在过去的十余年里，邻近标记（Proximity Labeling）技术从一种"细胞裂解后才看得清"的蛋白质组学方法，演变为可以在活体器官中原位捕捉动态相互作用的关键工具。这一切的起点，是一种来自大肠杆菌的生物素连接酶 BirA。

一、为什么需要"邻近标记"

传统免疫共沉淀（Co-IP）依赖抗体-琼脂糖的物理拉拽，对低丰度蛋白、瞬时相互作用、弱亲和力复合物的捕获效率很低。研究者更想要的是：在活细胞或活体环境中，把"和目标蛋白距离足够近"的所有蛋白都打上标签，再用链霉亲和素磁珠一次性拉下来做质谱鉴定。

这把"分子印戳"就是生物素——一种与链霉亲和素结合亲和力达到 fmol 级的小分子。打上生物素后，蛋白可以承受强裂解条件而不丢失"标记信号"，这一点是 FLAG、HA 等传统表位标签做不到的。

三代工具的关键差异

二、第一代：BioID——奠基之作

2012 年，Choi-Rhee 等人在 Methods Enzymol. 上首次报道了突变型 BirA 酶（称为 BirA*）。它将生物素活化为生物素-AMP（bioAMP），在 ATP 存在下对周围约 10 nm 半径内的蛋白赖氨酸残基进行共价标记。

优势显而易见：共价连接，不怕裂解；链霉亲和素拉下后可直接进入 LC-MS/MS 流程。劣势也同样明显——18–24 小时的标记时间让它几乎无法捕捉"动态过程"。对于像神经突触传递、内分泌脉冲这类分钟级生物学事件，BioID 给出的更像是一张"曝光过度的合影"。

三、第二代：TurboID / UltraID——把时间压缩到分钟级

2018 年，Ting 实验室通过定向进化在 BirA 上引入关键突变，得到了 TurboID。它的标记时间从 18 小时压缩到 10–30 分钟，活性提升约 15 倍，且能在活细胞、活体内工作。

此后，研究者又衍生出若干改良工具：

• UltraID：分子量仅 19 kDa，标记速度优于 TurboID，且本底低；

• Split-TurboID：将酶切成两个无活性片段，仅在目标蛋白-诱饵蛋白发生相互作用、两片段靠近时才能恢复活性，实现"事件驱动"的条件性 PPI 标记；

• miniTurbo / microID：在标签小、毒性低等不同维度上各有侧重。

对于化学背景的合成服务方而言，第二代工具的爆发带来了一个直接的需求增量：研究者对生物素化底物（biotin-AMP 前体类似物、bio-orthogonal 探针）、AviTag 短肽、点击化学 linker 的需求明显上升。

四、第三代：STePTag——从培养皿到活体器官

2026 年 6 月，中国科学院化学研究所的团队在 Angewandte Chemie 上发表了 STePTag（Switchable TurboID via Protein Tagging）技术。它的核心创新是给 TurboID 装上一个可被小分子调控的"分子开关"：

1. 将 TurboID 与大肠杆菌二氢叶酸还原酶（DHFR）融合；

2. DHFR 在无抑制剂 TMP 时被细胞降解，TurboID 处于"休眠"；

3. 加入 TMP 后 DHFR 稳定化，TurboID 同步激活；

4. 配合脂质纳米颗粒（LNP）递送 mRNA，可在注射后 30 分钟内完成小鼠肝脏分泌蛋白的原位标记。

借助 STePTag + 蛋白质组学，研究团队在生理条件下鉴定出 93 种肝脏来源的分泌蛋白，并在急性肝损伤模型中捕获了 40 种动态变化的肝脏分泌蛋白，解析了醛脱氢酶分泌在药物性肝损伤中的保护机制——全程无需转基因动物。

另一条值得关注的路线是 APEX2：在 H₂O₂ 存在下将生物素-酚氧化为寿命极短的自由基（< 1 ms），1 分钟内即可完成标记，是目前时间分辨率最高的邻近标记技术，但需注意氧化应激干扰。

五、对定制合成与分子探针的真实需求

邻近标记技术的每一次跃迁，背后都是一系列化学工具的配套升级：

• 生物素-NHS 酯、Biotin-PEG-NH₂、Biotin-炔基/Biotin-叠氮——核心标记试剂；

• AviTag 肽段（GLNDIFEAQKIEWHE）——位点特异性标记的"地址签"；

• BirA、TurboID、UltraID 重组蛋白——催化标记反应的"打标机"；

• 链霉亲和素磁珠——捕获环节的"吸铁石"。

对纳孚生物这样的化学定制服务商来说，这意味着一个稳定增长的长尾需求：荧光-生物素双功能探针、可裂解 linker 修饰的 biotin-probe、PEG 长度可调的 biotin-PEG-叠氮等订单逐年增加。我们建议课题组在做邻近标记方案设计时，把"探针合成"这一环节前置评估——一个高质量的探针往往决定了整组数据的成败。

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