在生命科学领域，"看见"蛋白质之间的相互作用一直是研究者最关心的问题之一。传统方法如免疫共沉淀（Co-IP）、酵母双杂交（Y2H）虽然经典，但要么依赖强非共价结合、要么需要脱离生理条件，难以捕捉那些"稍纵即逝"的弱相互作用和动态过程。邻近生物素标记技术（Proximity Labeling） 的出现，让我们第一次有机会在活细胞、甚至活体器官的生理环境下"冻结"蛋白互作网络。本文将系统梳理这条技术演进路径上的关键节点，并重点解读 2026 年 6 月《Angewandte Chemie》刚发表的 STePTag 技术。

一、邻近标记的核心思路：把"邻居"全部贴上标签

邻近标记的核心思想非常简洁：

把一个"生物素连接酶"（biotin ligase）融合到目标蛋白（bait）上，让它在活细胞内将周围的蛋白质全部加上生物素标签，再通过链霉亲和素（streptavidin）磁珠富集、质谱鉴定，从而"画"出 bait 周围 10 nm 内的完整蛋白网络。

这一过程有三大优势：

• 共价标记：酶促反应产生稳定的生物素-赖氨酸共价键，可耐受严苛裂解条件

• 原位捕捉：在活细胞、活体中完成，保留真实的时空信息

• 超高亲和力：生物素-链霉亲和素 Kd ≈ 10⁻¹⁴ M，是已知最强的非共价相互作用之一

二、技术演进四阶段：从 18 小时到 10 分钟，再到活体器官

2.1 BioID（2012）：开创时代，但速度太慢

2012 年问世的 BioID 利用突变的大肠杆菌生物素连接酶 BirA*（R118G），将生物素活化为 biotin-AMP，对周围约 10 nm 内的蛋白质进行非特异性生物素化。

局限：标记速度过慢，难以捕捉快速动态过程。

2.2 TurboID（2018）：速度革命

斯坦福大学 Alice Ting 团队通过定向进化对 BirA 进行改造，获得 TurboID —— 标记速度提升约 15 倍，10–30 分钟 即可完成有效标记。

围绕 TurboID，衍生工具不断涌现：

• miniTurbo：分子量更小（约 28 kDa），但活性略低

• Split-TurboID：酶拆分为两个无活性片段，PPI 发生时重新组装，背景极低

• UltraID（2026）：分子量仅 19 kDa，速度更快，适合空间受限体系和体内标记

• APEX2：走另一条路线——H₂O₂ 触发，1 分钟内完成标记，时间分辨率最高，但需注意氧化应激

2.3 REC 标签（2026）：解决"标签失明"

TurboID 的高活性带来一个"隐藏 bug"——标签失明：融合标签自身的赖氨酸残基会被大量生物素化，导致研究者无法用常规抗体（FLAG/HA）验证带标签蛋白是否正确表达。

2026 年《Scientific Reports》Tokunaga 等人报道了 REC 标签（REduced Lysine Content tag）：一个完全不含赖氨酸的短肽标签。TurboID 无法对其生物素化，因此在强标记条件下，REC 标签仍可被抗体清晰检测——这使得研究者能够同时研究基于赖氨酸的翻译后修饰（泛素化、乙酰化），而不会被标签本身干扰。

2.4 STePTag（2026 年 6 月）：从细胞跃升至活体器官

2026 年 6 月，中国科学院化学研究所研究团队在《德国应用化学》（Angewandte Chemie）发表了 STePTag 技术，首次将邻近标记从细胞水平拓展到活体器官水平。

核心技术设计：

研究成果：

• 在生理条件下鉴定出 93 种肝脏来源分泌蛋白

• 在急性肝损伤模型中捕获 40 种动态变化的分泌蛋白

• 解析了醛脱氢酶分泌在药物性肝损伤中的保护机制

三、技术选择建议

四、应用版图：不止于蛋白质

邻近标记的应用已从 PPI 拓展到更广阔领域：

• RNA-蛋白质互作：RNA-BioID 将生物素连接酶靶向特定 RNA，识别 mRNA 定位元件的结合蛋白

• 细胞表面蛋白质组：基于呋喃化学的生物素标记可高特异性标记细胞表面蛋白

• 空间可视化蛋白质组学：SVPro 技术整合邻近标记与荧光信号放大，已在阿尔茨海默病模型小鼠脑组织中成功应用

五、对定制合成的启示

邻近生物素标记的爆发式迭代，对底物与工具试剂的供应提出了更高要求：

• 生物素探针：Sulfo-NHS-SS-Biotin、Biotin-PEG-NH₂、Biotin-azide 等多种修饰臂需要稳定供应

• AviTag 肽段：位点特异性标记所需的 15 氨基酸短肽需要高纯度合成

• TMP 及其衍生物：DHFR 调控开关工具分子的稳定供应

• 链霉亲和素磁珠配套试剂：富集环节所需的高纯度缓冲液组分

纳孚生物长期为高校课题组与生物医药企业提供生物素标记全系列试剂与定制服务，包括 Biotin-PEGn-NH₂ / -COOH / -N₃ / -DBCO 全链长覆盖，并可按需定制 AviTag 肽段、生物素化抗体、生物素标记 Linker 等特殊规格。

结语

从 BioID 到 TurboID、再到 UltraID 与 REC 标签，2026 年的 STePTag 把邻近标记推上了"活体器官"的新高度。这条技术路线的每一次进化，都把蛋白质相互作用研究推向更接近生理真实的时空分辨率。对于研究者而言，了解每种工具的边界、按需选择，比追逐"最新"更重要。

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