邻近生物素标记技术已成为研究蛋白质相互作用的强大工具，但传统方法依赖质粒表达或CRISPR敲入将标记酶融合到目标蛋白上，步骤繁琐且耗时。2025年发表于 Nature Communications 的一项研究提出了ProtA-Turbo策略，无需基因操作即可实现对内源性蛋白邻近组的标记与鉴定，为原代细胞和临床样本的蛋白质组学研究开辟了新路径。

一、传统邻近标记的技术瓶颈

以TurboID为代表的邻近生物素化标记技术，通过将生物素连接酶融合到诱饵蛋白上，在添加外源生物素后催化邻近蛋白的生物素化，再通过链霉亲和素富集和定量质谱进行鉴定。该技术在相互作用蛋白质组学研究中展现了巨大潜力。

然而，TurboID的应用面临一个关键瓶颈：必须通过基因手段将TurboID融合到目标蛋白上。这带来了几个问题：

1. 操作复杂：质粒表达可能导致过表达伪影，CRISPR敲入耗时数周至数月

2. 细胞限制：原代细胞、干细胞等难以进行基因操作的细胞类型应用受限

3. 内源性丢失：过表达系统无法完全反映内源性表达水平下的蛋白质相互作用

4. 通量受限：每次只能研究一个目标蛋白，难以进行高通量筛选

二、ProtA-Turbo的设计原理

荷兰Radboud分子生命科学研究所的Michiel Vermeulen团队开发的ProtA-Turbo策略巧妙地绕过了基因操作的需求：

核心设计：

• 将蛋白A（Protein A）与TurboID融合，构建重组蛋白ProtA-Turbo

• 蛋白A能特异性结合大多数免疫球蛋白IgG的Fc段重链

• 利用针对目标蛋白的内源性抗体将ProtA-Turbo引导至目标位置

• 添加生物素后，TurboID催化邻近蛋白的生物素化

• 通过链霉亲和素富集和质谱鉴定邻近蛋白组

工作流程：

1. 甲醛固定细胞（保持蛋白质相互作用）

2. 使用毛地黄皂苷（Digitonin）温和透化细胞膜（保留细胞器完整性）

3. 加入针对目标蛋白的特异性抗体

4. 加入ProtA-Turbo重组蛋白，通过蛋白A-Fc结合定位

5. 添加生物素触发邻近标记

6. 裂解细胞，链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白

7. 定量质谱分析

三、验证结果与应用实例

3.1 靶点验证

研究团队使用多种内源性抗体验证了ProtA-Turbo的可行性和特异性：

免疫荧光结果显示，各组的生物素化信号与目标分子的已知亚细胞定位高度一致，证实了ProtA-Turbo的空间特异性。

3.2 质谱鉴定结果

定量质谱分析进一步验证了标记的生物学相关性：

• H3K9me3组：成功富集到甲基转移酶（如SUV39H1）、已知的H3K9me3 Reader蛋白（如HP1α/β）以及着丝粒相关蛋白

• Emerin组：富集到核膜相关蛋白复合物组分

• BRG1组：鉴定到BAF复合物的已知亚基

这些结果证明ProtA-Turbo能够真实反映目标分子周围的蛋白质组成。

四、ProtA-Turbo的技术优势

与传统TurboID方法相比，ProtA-Turbo具有以下显著优势：

五、对科研工作者的实用建议

5.1 适用场景

ProtA-Turbo特别适合以下研究场景：

• 原代细胞研究：难以转染的神经元、免疫细胞等

• 临床样本：FFPE或冷冻组织切片

• 翻译后修饰研究：利用修饰特异性抗体（如组蛋白修饰抗体）

• 快速筛选：需要在短时间内测试多个目标蛋白的相互作用组

5.2 注意事项

• 抗体质量：ProtA-Turbo的效果高度依赖抗体的特异性和亲和力，建议使用经ChIP或IF验证的抗体

• 固定条件：甲醛固定时间需优化，过长会降低抗原性，过短可能导致蛋白质相互作用丢失

• 透化策略：毛地黄皂苷的选择性透化保留了核膜完整性，但对于膜蛋白研究可能需要调整透化条件

• 生物素来源：使用高纯度生物素（≥98%），避免杂质影响标记效率

5.3 与其他技术的互补

ProtA-Turbo并非替代传统TurboID，而是互补关系：

• 活细胞动态研究：仍需传统TurboID或Split-TurboID

• 固定样本快照：ProtA-Turbo是理想选择

• 双重验证：两种方法结合可提高结果的可靠性

六、纳孚生物的标记试剂支持

ProtA-Turbo技术的推广使用将进一步提升对高质量生物素试剂和标记探针的需求。纳孚生物可提供：

• 高纯度生物素：满足邻近标记实验的严格纯度要求

• 生物素衍生物库：包括生物素-PEG_linkers、可裂解生物素、光交联生物素等

• 点击化学标记试剂：DBCO-Biotin、N₃-Biotin等，兼容多种标记策略

• 定制合成：根据实验需求定制特殊结构的生物素标记化合物

结语

ProtA-Turbo代表了邻近标记技术从"基因依赖型"向"即用型"转变的重要一步。通过巧妙利用蛋白A-IgG的天然相互作用，该技术将邻近标记的应用范围从可转染细胞系扩展到了原代细胞和临床样本，大幅降低了实验门槛。随着更多特异性抗体的开发和标记酶活性的优化，"即用型"邻近标记有望成为蛋白质组学研究的常规工具。

联系我们

纳孚生物 — 专业化合物定制合成与生物素标记服务商