从2012年BioID问世，到TurboID实现10分钟快速标记，再到2025年复旦大学Nature发表TransitID策略——邻近生物素标记技术正在重塑蛋白质相互作用研究范式。

一、技术背景：为什么需要邻近标记？

传统蛋白质相互作用研究方法（如免疫共沉淀、酵母双杂交、荧光共振能量转移等）存在明显局限：需要裂解细胞破坏天然环境、难以捕捉瞬时或弱相互作用、无法在活细胞中实时进行。

邻近生物素标记技术的出现，从根本上改变了这一局面。其核心思路是：将生物素连接酶融合至目标蛋白，酶在活细胞内催化生物素标记邻近蛋白，随后通过链霉亲和素富集标记蛋白并进行质谱鉴定。这一策略实现了活细胞内原位标记，保留了天然蛋白质相互作用环境。

二、技术演进全景

2.1 BioID：开启邻近标记时代（2012年）

BioID利用突变型大肠杆菌生物素连接酶BirA（R118G突变），将生物素转化为生物素-AMP（bio-AMP）并释放到环境中，标记半径约10 nm范围内的蛋白质。

特点：

• 标记速度慢，通常需要18-24小时

• 适用于长时间稳定相互作用的捕获

• 细胞毒性中等

2.2 TurboID：速度的革命（2018年）

TurboID通过定向进化对BirA进行改造，将标记速度提升了约15倍。

核心优势：

• 标记时间缩短至10-30分钟

• 适用于活细胞和体内实验

• 标记半径约10 nm，接近蛋白质复合物尺度

• 2026年最新研究中已成功应用于内皮细胞、神经元等多种细胞类型

2.3 AirID：低毒性方案

AirID（及其变体AirID2、AirID3）通过优化酶活性和细胞定位信号，在保持较高标记效率的同时显著降低了细胞毒性，特别适用于对细胞状态要求严苛的实验体系。

2.4 UltraID：小分子量优势

UltraID是近年来发展的超小型生物素连接酶变体：

• 分子量仅19 kDa，较TurboID进一步缩小

• 更容易被包装进病毒载体进行体内递送

• 融合蛋白构建时对目标蛋白空间结构影响更小

2.5 Split-TurboID：条件性标记

Split-TurboID将酶拆分为两个无活性片段，只有当两个片段因蛋白质相互作用而靠近时才恢复活性，实现了PPI的条件性标记，大幅提高特异性。

2.6 TransitID：时空精准控制（2025年）

2025年，复旦大学高强团队联合中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所韩硕团队，在Nature发表重要研究，提出利用邻近标记技术放大抗原诱导的细胞响应（"Amplifying antigen-induced cellular responses with proximity labelling"）。

该研究展示了邻近标记技术在免疫学领域的全新应用可能，标志着技术正从"互作捕获"向"功能调控"方向拓展。

三、技术横向对比

四、核心应用场景

4.1 蛋白质互作网络构建

系统鉴定特定蛋白的互作伙伴，构建高精度互作图谱。TurboID的快速标记能力使其能捕捉瞬时和动态的蛋白质相互作用。

4.2 细胞器蛋白质组学

将连接酶靶向特定细胞器（线粒体、内质网、细胞核等），鉴定该细胞器的完整蛋白质组，揭示亚细胞水平的蛋白质组成。

4.3 膜蛋白研究

膜蛋白溶解性差、丰度低，传统方法难以高效捕获。邻近标记克服了这一难题，高效捕获膜蛋白互作网络。

4.4 疾病靶点发现

通过比较正常与疾病状态下邻近标记谱的差异，发现新的疾病相关蛋白，为药物靶点挖掘提供线索。

4.5 药物作用机制研究

鉴定小分子药物的直接结合蛋白及下游信号复合物，揭示药物作用机制。2026年有课题组同时使用TurboID和APEX2标记同一靶蛋白，通过交叉比对两种标记数据集，显著提高了互作鉴定的可信度。

4.6 神经科学应用

2025年9月，北京生命科学研究所林睿实验室与北京脑科学研究所罗敏敏实验室在Neuron发表LINCS技术，利用改造的seTurboID（可溶性增强型TurboID）实现小鼠全脑神经元高亮标记。通过将TurboID与促溶标签GB1融合，解决了原始TurboID在神经元内表达不足的问题，实现了生物素标记沿长轴突神经元的完整覆盖。

五、技术选择建议

新手入门

推荐从TurboID开始——操作成熟、文献丰富、标记效率高，是邻近标记的"金标准"。

体内实验

推荐UltraID——分子量小，易于病毒载体包装，对目标蛋白功能干扰小。

高时间分辨率需求

推荐APEX2——1分钟标记窗口，精确捕捉特定时刻的互作。但需注意H₂O₂处理的氧化应激风险。

条件性标记

推荐Split-TurboID——仅在目标PPI发生时激活，背景极低。

严谨验证

推荐TurboID + APEX2双标记策略——交叉比对两种独立技术结果，提高可信度。

六、对试剂供应链的需求

邻近生物素标记技术的广泛应用，持续推动以下试剂需求增长：

• 生物素化探针：biotin-PEG-NHS等标记底物

• TurboID相关底物：生物素（标准试剂即可，无需特殊底物）

• 链霉亲和素磁珠：用于标记蛋白的富集

• 单价链霉亲和素：经工程化改造仅保留一个活性结合位点，解决大组织样品深层穿透和非特异性结合问题

• 生物素-酚（BP）：APEX2专用底物，非标准试剂需专门采购

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