导读： 同样是把生物素"打"到目标分子上，方法却大相径庭。本文系统梳理三大类标记策略的原理、适用底物与选择逻辑，帮你少走弯路。

一、化学标记法：最常用、最成熟

化学法通过小分子活化酯与底物官能团的共价反应实现标记，无需额外酶，试剂货架期长，是实验室最常用的策略。

NHS酯法（氨基偶联）

反应基团： 蛋白质的游离氨基（赖氨酸ε-氨基、N端α-氨基）

代表试剂：

• NHS-Biotin（水溶液不稳定）

• Sulfo-NHS-Biotin（磺化，水溶性更好，推荐）

• NHS-PEG4-Biotin（含PEG间臂，减少空间位阻）

操作要点：

1. 将蛋白稀释至0.5～2 mg/mL，置换至PBS（pH 7.2～7.5）；

2. 加入5～20倍摩尔过量的NHS-biotin（DMSO溶液），冰浴或4°C孵育1～2小时；

3. 脱盐柱（G-25）去除游离生物素；

4. HABA法测定标记度（DOL）。

适用： 绝大多数可溶蛋白、抗体、多肽

注意： 含伯氨基的缓冲液（如Tris、甘氨酸）会竞争反应，必须提前置换。

马来酰亚胺法（巯基偶联）

反应基团： 半胱氨酸的游离巯基（-SH）

代表试剂：

• Maleimide-PEG2-Biotin

• BMCC-Biotin

优势：

• 半胱氨酸在蛋白质中含量较低（天然稀有），标记位置更精确；

• 可通过引入单一Cys突变，实现位点特异性标记；

• 反应条件温和（pH 6.5～7.5，室温）。

注意： 样品中不能含还原剂（DTT、β-ME），否则会封闭巯基。可用TCEP（不与马来酰亚胺反应）替代。

二、酶促标记法：高特异性、高可控性

BirA酶直接标记

大肠杆菌生物素连接酶BirA仅识别特定的15氨基酸"AviTag"肽段（GLNDIFEAQKIEWHE），并在该序列的赖氨酸上精确安装一个生物素分子。

特点：

• 位点特异：每分子蛋白只标记一个生物素；

• 不影响活性：AviTag可融合于蛋白N端或C端；

• 可体外或体内标记：大肠杆菌表达时共表达BirA即可实现活体内标记。

应用场景： 需要精确控制标记位点的SPR动力学分析、结构生物学、定量蛋白质组学。

TurboID邻近标记

见本系列第一篇——TurboID通过"乱枪打鸟"的方式，将周围约10 nm内所有蛋白质都进行生物素化，用于蛋白质相互作用组学研究。

三、光激活标记法：精准时空控制

APEX/APEX2

• 在H₂O₂存在下，生物素-苯酚（biotin-phenol）被氧化为苯氧自由基，共价修饰邻近蛋白（~20 nm范围，1分钟内）；

• 适合亚细胞区室精细定位研究。

光敏生物素（Psoralen-Biotin）

• 含吡啶甲酮母核的光敏生物素在365 nm UV激活后，嵌入核酸双链并共价交联；

• 专用于RNA/DNA的生物素标记，适合核酸捕获、CLIP-seq等实验。

四、方法选择决策树

标记什么？
├── 蛋白质
│   ├── 需要随机标记多位点 → NHS酯法（首选）
│   ├── 需要位点特异标记  → AviTag/BirA酶
│   ├── 研究蛋白质互作组  → TurboID/BioID
│   └── 研究亚细胞蛋白组  → APEX2
├── 核酸
│   ├── DNA/RNA直接标记  → NHS酯法（修饰氨基化碱基）
│   └── 嵌入式交联标记   → 光敏生物素
└── 多肽
    ├── 含氨基 → NHS酯法
    └── 含巯基 → 马来酰亚胺法

纳孚生物定制标记服务

纳孚生物覆盖上述全部标记方法，支持：

• 小至毫克级的多肽生物素标记（NHS法/Mal法）；

• 蛋白质位点特异性生物素化（AviTag体系）；

• 核酸生物素修饰（固相合成直接引入生物素化碱基）；

• 提供完整分析报告（HPLC、MS、HABA标记度检测）。

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