引言

聚赖氨酸（Poly-L-lysine, PLL）的主体结构以赖氨酸单元通过肽键缩合而成。ε‑聚赖氨酸每个赖氨酸单元由ε‑氨基与相邻赖氨酸的α‑羧基连接成链，因而每条主链上分布着大量游离的ε‑NH₂。这些氨基赋予了聚赖氨酸丰富的化学修饰位点，能够通过酰胺键将两种不同的羧基小分子依次接枝在同一骨架上。常见的接枝靶标包括叶酸（羧基靶向）、阿魏酸、乙酰丙酸以及生物素，用于药物递送、抗菌材料或靶向载体。

核心理念：通过酰胺键实现双接枝

聚赖氨酸的侧链氨基数量远超羧基，因此所有接枝反应均以氨基与羧基间的酰胺缩合为核心。两种小分子可以按照主链上任一顺序固定于不同的氨基酸残基上。此过程的关键是活性酯中间体：利用EDC（1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺）/ NHS（N‑羟基琥珀酰亚胺）体系在缓冲液中活化小分子的羧基，生成亲电性较强的NHS酯，随后与聚赖氨酸的侧链氨基发生亲核取代形成稳定的酰胺键。对于中性或碱敏感的小分子，也可参考先保护后去保护策略，先将部分氨基用Fmoc或Boc保护，完成一种分子接枝后再脱去保护基团接枝另一种分子。

主要策略

策略一：顺序活化－接枝（分步法）

将两种小分子按设计的顺序分先后接枝。先将第一种羧酸用EDC/NHS在pH 4.5–5.5的缓冲液中活化，加入聚赖氨酸并维持溶液pH为中性以加速酰胺化反应。产物经透析或超滤去除多余小分子和EDC试剂，干燥后重复上述步骤接枝第二种羧基分子。此法适用于两种小分子活性差异较大、需精确控制比例的场景。

策略二：竞争接枝（一锅法）

将两种羧基小分子按设计摩尔比混合，同时进行EDC/NHS活化，再加入聚赖氨酸完成偶联。一锅法操作简单，但最终接枝比不易独立调控，建议先做预实验确定最优配比。

具体操作流程图

注意事项

• pH调控：EDC活化在酸性条件下最有效，但一旦生成NHS酯后应将反应液调至中性或弱碱性以促进氨基进攻。

• 投料比：过量的小分子会导致后续纯化负担加重，建议按目标接枝度计算摩尔比，一般小分子:EDC:NHS = 1:1:0.5或1:1:1。

• 产物纯化：未接枝的小分子和EDC试剂通过透析（截留分子量MWCO 3500Da）或超滤去除，最后冻干得到白色絮状固体。

• 质量控制：用¹H NMR积分比值计算接枝度，FT‑IR中酰胺I带（约1650 cm⁻¹）和酰胺II带（约1550 cm⁻¹）的增强可验证酰胺键形成。

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