分享一篇发表在JACS上的文章。文章的题目是“In Vivo Multiplexed Analysis of Aminopeptidase Activities by Hyperpolarized Molecular Probes for Tumor Diagnostic Applications”。该工作的通讯作者为来自东京大学工学研究科的 Shinsuke Sando教授，其研究主要集中在化学生物学、核酸化学以及分子探针的开发与应用。
氨肽酶（Aminopeptidases, APs）是一类能够以序列依赖的方式特异性识别并切割蛋白质及肽链N端氨基酸残基的关键酶。其中，与肾素-血管紧张素系统（RAS）密切相关的四种氨肽酶——氨肽酶N（APN, E.C. 3.4.11.2）、氨肽酶A（APA, E.C. 3.4.11.7）、氨肽酶B（APB, E.C. 3.4.11.6）以及亮氨酸氨肽酶（LAP, E.C. 3.4.11.3）——在调控血管生成、血压维持等循环系统功能中发挥着核心作用。在RAS通路中，APA负责将血管紧张素II（Ang II）转化为Ang III，随后Ang III被APN、APB和LAP进一步降解为Ang IV。这些酶协同作用，动态调节血管紧张素肽水平，从而维持RAS系统的稳态。
研究表明，在多种恶性肿瘤中，特定氨肽酶的活性显著上调，并深度参与肿瘤血管生成、细胞迁移、侵袭及转移等恶性进程。因此，氨肽酶活性被视为极具潜力的肿瘤生物标志物。然而，现有的检测手段面临显著局限：传统的免疫组化和荧光探针技术通常依赖侵入性组织活检，或受限于光学成像的组织穿透深度，难以实现深部肿瘤的体内实时监测；常规磁共振成像（MRI）虽具备优异的软组织分辨率和深层穿透力，但受限于固有的低灵敏度，无法直接检测低浓度的代谢物或酶促反应。动态核极化（DNP）耦合MRI技术的出现为突破这一瓶颈提供了新契机。该技术可将13C标记分子的信号增强逾10000倍，使得实时监测体内代谢过程及酶活性成为可能。尽管前景广阔，目前的DNP-MRI多重分析仍面临两大挑战：一是适用于体内的功能性探针种类匮乏；二是大多数13C标记探针的信号峰集中在狭窄的化学位移范围（170–180 ppm），导致谱峰严重重叠，难以区分多种酶的活性。此外，现有探针大多针对单一代谢物（如丙酮酸），缺乏能够同时解析多种酶活性的“多重分析”策略。
鉴于此，本研究旨在开发一组新型超极化13C标记分子探针，用于在活体水平上对肿瘤微环境中的氨肽酶活性进行多重（Multiplexed）、非侵入性分析。通过理性设计，作者构建了具有不同化学位移、高酶反应活性及长自旋-晶格弛豫时间（T1）的专用探针组合，以解决信号重叠难题，实现对多种RAS相关氨肽酶活性的同步检测与可视化，为肿瘤的精准诊断及疗效评估提供全新的影像学工具。
在探针设计方面，作者采取“N端调控酶特异性，C端调控化学位移”的策略：N 端优化（酶特异性）：基于二肽骨架（Xaa-Gly/Ala），筛选出对四种目标酶具有高特异性和快速反应活性的N端氨基酸：丙氨酸（Ala）靶向APN，谷氨酸（Glu）靶向APA，精氨酸（Arg）靶向APB，亮氨酸（Leu）靶向LAP。C 端修饰（化学位移调控）：为解决信号重叠问题，作者通过量子力学计算预测，并在C端酰胺基引入不同的微小取代基（如-NHMe, -NMe2, 吡咯烷基等）及改变主链氨基酸（Gly/Ala）。这一策略成功将探针及其产物的13C化学位移分布在超过10 ppm的范围内，确保在3 T磁场下各峰间距大于1.0 ppm，实现光谱分离。此外，作者还在标记碳的α位引入氘代，以减少偶极-偶极弛豫，显著延长自旋-晶格弛豫时间（T1），确保探针在超极化状态下有足够的时间完成体内注射和成像。最终开发出四种优化的二肽探针：Ala-[1-13C]Ala-d-NHMe（靶向APN）；Arg-[1-13C]Ala-d-NMe₂（靶向APB）；Glu-[1-13C]Gly-d₂-NMe2（靶向APA）；Leu-[1-13C]Gly-d₂-吡咯烷基（靶向LAP）。
随后作者将探针在体外与体内的性能进行了评估。在物理化学性质方面，验证了探针的高水溶性（>1 M）、生物相容性（无需毒性玻璃化试剂即可超极化）以及较长的 T1值（>20 秒）。
在酶反应特异性方面，在纯化酶、细胞匀浆及抑制剂存在条件下，证实了各探针仅被其对应的目标酶切割，且反应迅速。在共极化与多重检测方面，成功实现了四种探针的混合共极化。在体外及健康小鼠体内实验中，通过单次注射和一次扫描，清晰地同时检测到了8个独立的信号峰（4个底物峰 +4个产物峰），证明了多重分析的可行性。最后，作者也在健康小鼠肾脏及荷瘤小鼠腿部进行了化学位移成像（CSI），成功可视化了不同组织中AP活性的空间分布差异，揭示了肿瘤微环境的异质性。
综上所述，该研究提供了一组强大的新型分子探针，建立了一种全新的体内多重酶活性分析范式。这种方法为深入理解RAS系统在肿瘤血管生成中的作用、实现肿瘤的精准分型以及指导个体化治疗提供了强有力的技术手段，具有广阔的临床转化前景。
本文作者：THT
责任编辑：TYC
DOI：10.1021/jacs.5c16910
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16910
