分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章：A Chemical Proteomics Method to Quantify Cysteine S-Acylation，通讯作者是波尔多大学的Emmanuelle Thinon教授，课题组的研究方向是利用化学和生物学方法研究小膜蛋白。

S-酰化（S-acylation，常特指S-棕榈酰化）是将长链脂肪酸通过硫酯键共价连接到蛋白质半胱氨酸（Cys）侧链的可逆、动态翻译后修饰。该修饰在蛋白质膜定位、信号转导、蛋白-蛋白相互作用及疾病发生中扮演核心角色。然而，与磷酸化、泛素化等研究相比，S-酰化的大规模定量分析长期面临三大瓶颈：1）硫酯键化学不稳定，样品制备过程极易水解或重排；2）细胞内 S-酰化处于快速“酰化-去酰化”循环，静态snapshot难以反映真实丰度；3）传统“酰基-生物素交换（ABE）”或“酰基-树脂辅助捕获（acyl-RAC）”流程通量低、假阳性高，且只能给出“有/无”定性结果，无法在一次样品中给出每个Cys的绝对或相对酰化修饰率。因此，开发一种能在全蛋白质组水平、单半胱氨酸分辨率下精确定量S-酰化占比的化学蛋白质组学方法，是领域亟待解决的关键技术缺口。

为了解决这一难题，作者提出“两步同位素标记”策略（PASSILE），主要流程如下图所示：首先用Cys反应性探针封闭所有游离巯基，此处用的是轻标探针（light），然后用羟胺（HA）选择性切断S-棕榈酰化的硫酯键，释放出原先被S-棕榈酰化的Cys巯基，接着用重标同位素标记探针（heavy）对新暴露的巯基进行二次标记，这样同一条未被修饰（light）和被S-棕榈酰化修饰（heavy）的肽在LC-MS/MS可以共流出。最后通过经典的点击化学反应将探针上的炔基与含叠氮的biotin-azide连接、高亲和力富集、酶解，再利用高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）-LC-MS/MS 分离标记肽段，通过轻/重同位素比值直接计算每个Cys 的S-棕榈酰化占比。

作者针对实验流程进行了优化。主要是探针的组合，作者比较了两种炔基碘乙酰胺探针（IAA-Bn和IAA-iPr）与4种biotin-azide试剂的组合（A-H），最后选择IAA-Bn/ADADPSB（couple B）对PASSILE方法进行进一步优化，并在其余研究中使用。

最后，作者利用这一实验流程，进行了HeLa细胞裂解液中S-棕榈酰化位点的修饰率定量，并对自噬诱导下的修饰率变化进行了评估。

综上，本文作者开发了一种能在全蛋白质组水平、单半胱氨酸分辨率下精确定量S-棕榈酰化占比的化学蛋白质组学方法，将传统定性/半定量分析升级为精确修饰率测定。

本文作者：MB

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/acschembio.5c00824

原文链接：https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00824