分享一篇发表在JACS上的文章，标题为“Terminal Conjugation Enables Nanopore Sequencing of Peptides”，通讯作者为来自荷兰代尔夫特理工大学的Cees Dekker教授，他是纳米孔测序领域的知名学者。

DNA和RNA的纳米孔测序改变了基因组学和转录组学，然而，肽段缺乏均匀的负电荷和稳定的可预测结构，使其容易易位，难以稳定进入纳米孔，且其自由易位也导致在纳米孔内停留时间较短，难以获得准确的检测信号。因此，研究者开发了DNA-肽段偶联策略，用DNA马达酶辅助控制肽段运动，来获得良好的检测信号。然而，目前的DNA-肽段偶联策略要么依赖于N端或C端特定的氨基酸残基或基序，要么缺乏反应特异性，容易与非末端氨基酸偶联，因此难以用于天然肽段测序。因此，作者希望开发一种普适的DNA-肽段偶联方法，用于天然肽段的纳米孔测序。

对于肽段N端，作者先用5’端携带有马来酰亚胺的DNA寡核苷酸与一种连接肽的N端半胱氨酸偶联，再使用 Omniligase 酶催化肽段N端与C端带有活化酯的酰基供体连接肽偶联，形成DNA-连接蛋白-肽（DLP）偶联物，随后用MspA 纳米孔/Hel308 解旋酶系统进行测序。作者发现，长肽段（23-26AA）仅需N端偶联即可产生稳定、可区分的离子电流信号，不同肽段的序列差异可被识别。然而，短肽（8-11AA）在这种策略下的检测信号却难以被重复。作者认为，短肽在纳米孔内更容易易位，这种情况下电泳力不足以维持短肽结构稳定所需的张力。

为此，作者进一步对短肽的C端进行偶联。作者采用光氧化还原脱羧反应，在可见光照射下选择性激活C端羧基，引入含炔基的接头；随后通过铜催化叠氮-炔环加成反应连接叠氮修饰的DNA尾链（dT30），形成DNA-接头-肽段-接头-DNA（DLPLD）复合物。这种C端带负电的DNA尾链提供了稳定的拉伸力，显著延长了肽段在孔中的停留时间，实现了可靠检测。

最后，为了克服正电荷肽即使与DNA偶联也会因为电场力相反易位的问题，作者使用NHS酯乙酰化肽段的赖氨酸残基对正电荷进行中和，使得高正电的肽段也可顺利进入纳米孔并获得可靠的检测信号。

总之，作者开发了一种肽段双末端定向偶联DNA的化学策略，实现了天然肽段的纳米孔测序。

本文作者：ZCL

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/jacs.5c18813

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c18813