分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Ketoboronate as a Minimal Covalent-Reversible Tag for Targeted Lysosomal Degradation of Extracellular and Membrane Proteins”。通讯作者为伊利诺伊大学芝加哥分校的Alexander Adibekian教授，其研究方向为化学蛋白质组学和药物发现。

溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）和类似技术的发展为细胞表面或细胞外蛋白的靶向降解提供了前所未有的机会，然而，目前该类技术多数使用分子量较大的糖肽或糖聚合物来结合细胞表面效应器（如M6PR等，最近也有使用蛋白binder靶向转铁蛋白受体（TfR）实现溶酶体降解的报道），这使相关制剂的合成易得性、稳定性和免疫原性均面临较大的挑战。相反地，寻找一种“最小降解标签”则有望拓展这类溶酶体靶向蛋白降解技术的适用性。

作者早期曾致力于开发一类硫醇介导的细胞摄取方法，例如，通过芦笋酸（AspA）环状二硫键与半胱氨酸残基间的交换反应，可将肽、蛋白或成像试剂等“货物”共价连接到细胞表面的关键受体上，从而实现货物的递送。然而，细胞表面活性半胱氨酸的数量稀少，相比之下，赖氨酸残基则更为丰富。本文中，作者受到一种赖氨酸修饰反应的启发：酮硼酸类化合物可与赖氨酸侧链氨基形成席夫碱形式的可逆共价键，利用这一反应，或可实现“胺介导的摄取（amine-mediated uptake）”。

由此出发，作者以荧光素为模型“货物”，开发并测试了这种摄取策略。作者在荧光素上偶联了一系列苯基硼酸结构片段，其中硼酸基邻、对位的取代基均尝试了不同的候选。细胞成像结果表明，化合物5具有最强的细胞摄取能力，且强于基于芦笋酸-硫醇摄取策略的对照化合物7。为了进一步证明这种细胞摄取作用是依赖于赖氨酸侧链氨基的，作者使用广谱赖氨酸反应性探针STP预封闭细胞表面的活性赖氨酸残基，该处理阻断了细胞对化合物5的摄取。上述结果初步证明了氨基介导的摄取这一策略的可行性。

随后，作者尝试参与这一摄取过程的关键蛋白效应器。通过NaBH3CN还原处理，作者将以可逆共价键连接在细胞表面的炔基探针转化为不可逆共价连接，随后通过化学蛋白质组学分析鉴定其共价标记的蛋白。结果显示，探针强烈地富集了两种质膜蛋白：TFRC和HLA-ABC。随后的机制验证表明，关键赖氨酸残基的突变将显著减少探针对TFRC的标记，此外，TFRC和HLA-ABC的单独或共同敲低都将破坏细胞对探针的摄取，支持了这两种质膜蛋白在酮硼酸类探针摄取中的关键作用。作者也展示了酮硼酸-氨基可逆共价连接的关键优势：所形成的亚胺硼酸键是酸不稳定的，可以在低pH下断开并释放出“货物”。

最后，作者为这种策略寻找了巧妙的应用场景：可将酮硼酸作为一种溶酶体靶向标签，实现细胞表面/细胞外蛋白的内化和降解。作者以胞外链霉亲和素为模型成功验证了这一设计，随后尝试了广泛的应用，包括EGFR、HER2和VEGFA的溶酶体靶向降解。以HER2为例，作者通过SPAAC反应将酮硼酸标签偶联到曲妥珠单抗上，在细胞和荷瘤小鼠模型上均实现了强效的HER2降解。

总结而言，作者开发了一种基于酮硼酸-氨基反应的细胞摄取策略，并以酮硼酸作为“最小降解标签”，实现了多种蛋白的溶酶体靶向降解。

本文作者：TYC

责任编辑：WYQ

DOI：10.1021/jacs.5c16611

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16611