介绍一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Development of a Thiol−ene Microfluidic Chip for Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)，该研究的通讯作者是来自丹麦哥本哈根大学药学系蛋白质分析领域的Kasper D. Rand教授。
氢/氘交换质谱技术是现代结构生物学中一项不可或缺的强大工具，它通过精确测量蛋白质主链酰胺氢与溶剂中氘原子发生交换的动力学速率，能够灵敏地揭示蛋白质在溶液中的动态构象变化、折叠过程以及与其他生物分子的相互作用机理，是对X射线晶体学、冷冻电镜等静态结构解析技术的有力补充。然而，尽管其应用价值巨大，这项技术自诞生以来便长期面临着两个难以逾越的瓶颈：首先是其运行严重依赖昂贵且需要专业温控系统的超高效液相色谱设备，这极大地提高了技术门槛和研究成本；其次是存在于分析过程中几乎无法避免的“回交换”现象——即在氘标记反应被淬灭之后、质谱检测之前，那些已经标记在蛋白质或肽段主链酰胺上的氘原子，会与流动相中的普通氢原子发生逆向交换，导致宝贵的氘标记信号在检测前大量丢失。在目前通行的商业系统中，这种信号损失率通常高达30%至50%，这无疑严重侵蚀了数据的准确性、动态范围和可靠性，限制了该技术在更复杂体系中的应用。
为了从根本上突破这些技术瓶颈，Kasper D. Rand教授所领导的团队经过精心设计与反复验证，成功开发出了一款名为HDXchip的创新型微流控芯片平台。这款芯片的核心基材选用了具有优异生物相容性和化学稳定性的硫醇-烯聚合物，并采用了一种快速、廉价且适于规模化生产的两步复制模塑工艺进行制造。该芯片设计的精妙之处在于，它将一个完整氢/氘交换质谱工作流程中所必需的所有关键操作单元——包括样品引入与定量的样品环、用于在线快速酶解的固定化胃蛋白酶整体柱微反应器、以及基于反相色谱原理实现对肽段或蛋白质进行脱盐、浓缩和梯度洗脱分离的色谱腔室——高度集成在了一个仅有数平方厘米的微型芯片之上。
图1.HDXchip原理图和设置。(A) HDXchip包含一个样品环，(AA)取样回路入口和ASM入口。(AB)样品回路出口。(AC)原位形成用于胃蛋白酶固定的整体块的芯片面积。(AD)甲醇ASM入口。(AE)BSM入口。(AF) RP固定相的芯片面积。(AG)与阀门相连的脱盐出口。(AH)质谱仪出口，(AI)虚线表示芯片与铝热电偶接触的部分。(B) 3d打印芯片支架(黑色)、铝热电偶、Peltier模块和液体散热器效果图。
然而，这款芯片的创新之处远不止于集成化。研究团队为其量身定制了一套高效且精准的温度控制系统，该系统利用多个堆叠的帕尔贴模块作为制冷核心，配合高效的液体循环散热装置，能够将芯片上进行色谱分离的关键区域持续且稳定地冷却至零下20摄氏度甚至更低的温度。这种主动式的深度冷却能力，为抑制回交换提供了物理上的根本解决方案，而芯片自身微小的热质量使得这种快速降温成为可能，这是传统庞大而笨重的液相色谱系统所无法企及的技术优势。
为了科学且严谨地评估这款HDXchip芯片的实际性能，研究人员设计了一系列从简到繁的实验。他们首先选用了几种结构明确的小分子模型肽以及胰岛素作为测试对象，专门用于量化芯片在抑制回交换方面的效能。实验结果表明，当HDXchip在零下20摄氏度的深度冷却环境下，并以优化后的快速洗脱模式运行时，几种模型肽所测得的回交换率显著低于文献中普遍报道的数值，最低甚至出现了负值，这一现象暗示在某些特定条件下，氘标记不仅没有损失，可能还存在部分非酰胺氢的保留贡献，但总体而言，其回交换控制水平远优于传统系统通常30%至50%的损失率。这初步证明了零下温度对于减缓逆向交换速率的压倒性优势。
图2.最大氘标记的模型肽和蛋白质的反向交换。
在验证了基础性能后，研究人员进一步探索了HDXchip在更复杂分析场景中的应用能力。他们首先进行了“全局”氢/氘交换分析，即直接分析完整的蛋白质分子。研究人员将胰岛素、泛素和β-乳球蛋白三种蛋白质的混合物进行氘标记后，直接在芯片上（不经过在线酶解步骤）进行脱盐、分离和质谱检测。
图3.胰岛素、泛素和β-乳球蛋白的全球HDX-MS分析。
结果令人满意，HDXchip成功地区分并高重复性地绘制出了这三种蛋白质各自随时间推移而逐渐摄入氘的动力学曲线，其变化趋势完全符合折叠蛋白质预期的动态行为，并且整体回交换率被控制在了一个较低的水平。这充分证明了该芯片在处理完整蛋白质构象分析方面的稳健性与可靠性。
然而，真正的挑战和芯片价值的极致体现在于其“局部”氢/氘交换分析能力，这要求芯片必须完美集成从酶解到分离的全流程。研究团队选择了结构更为复杂的血红蛋白作为模型，进行了一次完整的时间分辨局部HDX-MS分析。在这个实验中，氘标记后的血红蛋白样品被注入芯片，随后在流经固定有胃蛋白酶的整体柱微反应器时被快速酶解成肽段，这些肽段紧接着被输送至填充有C18填料的反相色谱腔室进行脱盐和梯度洗脱分离，最后直接进入质谱仪进行检测。整个流程在零下20摄氏度的低温保护下流畅进行。
图3.HDXchip局部HDX-MS分析血红蛋白。(A)Hbα中分析的肽的联合提取离子色谱图。(B)Hbα(24peptides整理的HDX-MS数据的覆盖图，覆盖率97.2%，冗余度3.59)。二级螺旋结构用方框标记。(C)Hbβ(13多肽整理的HDX-MS数据的覆盖率图，覆盖率为87.8%，冗余度为1.82)。二级螺旋结构用方框标记。(D)Hbα肽2−30的时间分辨HDX-MS数据。(E)Hbβ肽段33 - 42的时间分辨HDX-MS数据。
最终的分析结果非常出色：芯片不仅实现了对血红蛋白α和β两个亚基分别高达97.2%和87.8%的序列覆盖率，能够精准定位氘原子在蛋白质不同区域的摄入情况，更重要的是，对所有鉴定出的肽段进行统计后发现，其平均回交换率仅为25.4%。这一数值相较于使用传统超高效液相色谱系统进行同类分析时常见的回交换水平，降低了超过二十个百分点，这是一个质的飞跃，极大地提升了对蛋白质局部构象动态变化的解析精度。
图4.HDX数据到晶体结构的映射。(A, B)标记10 s后用归一化HDX数据绘制的血红蛋白(PDB: 4hbb)晶体结构图。晶体结构的着色显示了归一化的摄取。灰色表示在时间分辨HDX数据中未覆盖的蛋白质区域。位于α1β1-α2β2间期αG和βG螺旋的受保护肽的HDX谱显示黑色(C, D)血红素组;最大标记的样品显示为十字形。(E, F)βA螺旋中未结构铰链区域Hbαin的肽71 - 81和Hbβsituated的肽2 - 15的HDX谱，标记最多的样品显示为交叉。
综上所述，这项由Rand教授团队所完成的研究工作，通过其设计的HDXchip微流控平台，巧妙地利用了微流控技术的集成化、小型化优势，并结合了深度冷却这一革命性的手段，成功地攻克了传统氢/氘交换质谱技术在设备成本和分析准确性方面长期存在的核心难题。这款芯片不仅通过高度集成简化了繁琐的操作流程，降低了技术门槛和样品消耗，更通过其卓越的温控能力将回交换抑制到了一个前所未有的低水平，从而显著提升了氢/氘交换实验数据的质量和信息含量。这项研究为氢/氘交换质谱技术乃至更广泛的蛋白质结构分析领域，指明了一条通向更高效率、更低成本、更优性能的全新发展路径，未来通过进一步集成其他功能单元或与离子淌度等技术联用，必将在生物制药、疾病机理研究和基础结构生物学中发挥越来越重要的作用。
这篇文章介绍了一种用新型硫烯材料制作的微流控芯片，专门用于氢氘交换质谱分析。它就像给实验室装上了“不粘锅”和“自动化流水线”，能极大地加快分析速度，并有效防止样品损耗，让蛋白质结构研究变得更高效、更精准。
撰稿：令狐克凤
编辑：李惠琳
参考文献
1.Hansen AB, Svejdal RR, Aerts JT, Stahlhut VBP, Harmash D, Hamidi M, Sticker D, Kutter JP, Rand KD Development of a Thiol-ene Microfluidic Chip for Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS). Anal Chem. 2025 Jun 24;97(24):12503-12512. doi: 10.1021/acs.analchem.4c06230. Epub 2025 Jun 9. PMID: 40488672; PMCID: PMC12199231.
