分享一篇发表在Nature Chemistry上的文章，题目为“Engineered reactivity of a bacterial E1-like enzyme enables ATP-driven modification of protein and peptide C termini”，通讯作者是来自美国威斯康星大学麦迪逊分校的Amy M. Weeks教授，研究方向包括时空分辨的PTM研究、蛋白质工程化改造以及化学蛋白质组学。在本文中，作者发展了一种基于蛋白酶促的C端标记方式。

在生物体中，ATP 驱动的腺苷酸化（adenylation）可以为肽键形成提供热力学动力（ΔG°′≈−46 kJ mol⁻¹），然而目前科学家还缺乏利用这种策略的工具。目前主流的蛋白C端生物偶联策略依赖于转肽反应，如sortase等。这些方法存在底物范围窄、产率受限等缺陷。因此，本文作者希望开发了一个基于细菌样泛素激活（E1）酶MccB的ATP驱动平台，用于蛋白C端激活和肽连接。

大肠杆菌 MccB 是E1样酶超家族的成员，可在消耗一分子ATP的条件下催化其七肽底物MccA（MRTGNAN）产生C端腺苷化（O-AMP）中间体，而后中间体与天冬酰胺侧链酰胺反应形成琥珀酰亚胺中间体，随后被 N-AMP化并水解形成C端isoAsn-AMP产物。基于这一催化机制，作者提出可以将C端Asn突变为其他氨基酸使得底物停留在O-AMP这一步，在肽段本身在没有亲核性残基的条件下可以通过外源引入亲核试剂实际实现C端修饰。为实现这一目标，作者合成了一个将Asn突变为其他19种氨基酸的MccA-N7X肽库并检测焦磷酸的生成，他们发现MccA-N7G突变催化效率最高，因此将其作为MccB底物，并命名为TeCH标签。

接下来，作者以C端修饰产物作为readout对亲核试剂进行了筛选。他们发现加入烷氧胺和肼能够检测到相应质量的C端修饰产物，但如果是基于苯肼的亲核探针则无法修饰在MccA-N7G的C端，表明亲核基团的大小是影响修饰效率的重要因素。随后他们发现硫醇亲核试剂的反应效率最高，均能以76-98 %的产量修饰MccA-N7G。

随后，作者希望进一步拓展C端修饰的酶和底物对，他们首先将MccA每个位置的氨基酸突变为其他19种经典氨基酸，但发现只有MccA-WT能够完全转化为产物，表明 MccB对底物识别具有严格的特异性。作者又进一步对其他细菌中MccB蛋白的非同源底物的催化活性，最终发现EcMccB/EcMccA、HpMccB/HpMccA 和 LjMccB/LjMccA可作为相互正交的酶-底物对。

最后，作者将此方法应用在了表达蛋白连接（EPL）的体系中。Subtiligase在连接过程中存在水解副反应，而在其基础上加入MccB 进行ATP依赖性硫酯的生成则可以使得水解产物再生，提高连接效率。作者实现了在1h内将含叠氮/炔基的功能肽偶联到5种不同蛋白，产率为70–99%。此外，作者还将此方法应用在了细胞表面GFP特异染色等方面。

总的来说，本文中，作者基于E1样蛋白MccB开发了一种用于C端修饰的ATP驱动平台，实现了蛋白和多肽的C端修饰。

本文作者：WYQ

责任编辑：LYC

DOI：10.1038/s41557-025-01871-3

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41557-025-01871-3