推荐一篇发表在JACS上的文章“Triple Labeling Resolves a GPCR Intermediate State by Using Three-Color Single Molecule FRET”，通讯作者是来自法国蒙彼利埃大学的Robert B. Quast和来自德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学的Don C. Lamb，其中Quast教授的研究方向是活细胞成像和结构生物学，Lamb教授的研究方向是FRET和荧光显微镜。

研究动态蛋白质复合物中构象变化具有较大的挑战性，因为大多数结构方法依赖于大量分子状态的平均信息。单分子FRET是监测此类构象变化的有力工具。本文中，作者提出了一种正交的三重标记策略，该策略不受天然反应性氨基酸功能的影响，通过在人代谢型谷氨酸受体 2（mGlu2，一种二聚体、多结构域的神经G蛋白偶联受体）上建立3色传感器，并使用3色单分子FRET描述以前未知的构象中间状态。

mGlu2受体对调节神经元兴奋性和突触传递至关重要，这种二聚体的冷冻电子显微镜结构表明其可以从无活性的静止开放（RO）状态转变为活动的关闭激活状态（AC）。这一结构变化主要涉及配体（谷氨酸作为激动剂）诱导VFT结构域的闭合，两个亚基相对于彼此的重新定位，使VFT结构域的下叶更接近，以及相邻7个跨膜结构域的界面变化。然而近期研究发现两种状态之间存在动态平衡，即静息和活动状态之间存在中间状态，研究VFT结构域的闭合和重定向过程对于识别和表征这一中间态是十分必要的。

为了表征这种潜在的中间状态，作者建立了一种基于两种不同非天然氨基酸和一个SNAP 标签的正交、位点特异性三重标记策略。第一个供体选择了SNAP标签标记，主要是由于它不会影响表达产量，并且代谢标记反应快速且选择性强；在第二个位点，作者选用反式环辛烯赖氨酸（TCOK）与四嗪染料衍生物之间的SPIEDAC组合来连接；第三个位点选择了掺入的PrF与吡啶甲基叠氮化物染料衍生物之间CuAAC反应来连接。最终作者测试了三重标记反应选择性良好且有较好的响应信号，得到3色传感器。

接下来，作者同时测量了所有染料对之间单二聚体的FRET并研究了单个原聚体内的上下裂片（D1 →A2）以跟踪VFT结构域关闭；以及两个原聚体之间的下裂片（A1/D2 → A2）以跟踪它们的重新定向。这一结果促使作者发现了一种以前未表征的中间状态：其中VFT结构域仅略微闭合，下叶保持静止时的分离构象。

总的来说，本文基于正交的三重标记策略建立了蛋白上的三色FRET传感器，发现了 mGlu2受体以前未知的中间状态。

本文作者：FTY

责任编辑：MB

DOI：10.1021/jacs.4c18364

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c18364