推荐一篇发表在NCB上的文章，题目为“Antibody–peptide conjugates deliver covalent inhibitors blocking oncogenic cathepsins”，通讯作者是来自瑞士洛桑联邦理工学院的两位科学家Bruno E. Correia 和Elisa Oricchio，前者的研究方向为蛋白质工程，后者为致癌基因组的研究和功能分析。
半胱氨酸组织蛋白酶（cysteine cathepsins）是一个蛋白酶家族，是治疗癌症等疾病的靶点。然而，还没有任何以该蛋白为靶点的药物被批准用于临床，因为它们的系统性抑制会引起严重的副作用。因此，作者通过将非天然肽抑制剂（non-natural peptide inhibitors, NNPIs）偶联到抗体上，开发了一个基于模块化抗体的靶向药物递送平台。NNPIs被活性弹头功能化以实现共价抑制，通过深度饱和诱变优化后与抗体偶联以实现细胞类型特异性的药物递送。作者首先以从cathepsin S（CTSS）的底物CD74序列中提取的八聚肽LRMKLPKP为模板，在N端添加赖氨酸以备将来的功能化，并在C端用天冬氨酸取代脯氨酸，因为它增加了肽与CTSS结合的能力。作者在四个不同的位置引入Michael受体，尝试设计共价抑制剂，其中NNPI-1和NNPI-2的Michael受体在肽链的侧链，NNPI-3的受体作为骨架取代了原本的亮氨酸，NNPI-4的受体则在截短肽的N端。作者通过使用荧光共振能量转移（FRET）试验，测试了这些 NNPIs抑制CTSS的能力，并发现只有NNPI-3 降低了蛋白酶活性，尽管效率较低，NNPI-3也可以抑制CTSB和CTSK，但对H、Z和L没有可测量的活性。因此。作者构建了一个含有126个NNPIs的文库，通过单位点饱和突变优化NNPI的抑制效果和特异性。然后根据单位点突变的结果测试双突变对酶活抑制效率的影响，并最终确定NNPI-C10是最有效的CTSS抑制剂（部分抑制CTSB），NNPI-D5是CTSB的高特异性抑制剂。作者还发现NNPI-E15是一种很有前景的CTSK抑制剂，因此作者用NNPI-E15作为第二个NNPI库的起点，并确定NNPI-F17是最佳的CTSK抑制剂，NNPI-G14是最佳的CTSKL抑制剂。
为了证明NNPI-C10和CTSS的共价结合，作者将荧光化的NNPI-C10和CTSS蛋白孵育后进行凝胶电泳，发现预期蛋白分子量处成功出现荧光条带，并可以被预孵育CTSS的小分子抑制剂E64竞争。而先孵育NNPI-C10，在再孵育E64则不能使荧光条带消失，证明NNPI-C10的抑制是不可逆的共价结合。此外，作者用单键取代Michael受体中的双键，发现这种改变消除了其共价阻断CTSS活性的能力。作者还在变性条件下使用完整质谱分析进一步证实了CTSS和NNPI之间形成了共价键。最后，作者通过获得了CTSS蛋白和NNPI-C10的结晶，证明了NNPI-C10在催化口袋中的结合正如期望的那样，Michael受体与催化中心的C139形成共价键。
最后，作者利用马来酰亚胺化学，设计了一系列设计了抗体-肽抑制剂偶联物（antibody-peptide inhibitor conjugates, APIC）将NNPI-C10与anti-CD22或anti-CD79抗体结合靶向B细胞淋巴瘤，NNPI-D5与anti-HER2抗体偶联，靶向乳腺癌细胞，阻断实体肿瘤中CTSB的活性，而NNPI-F17和NNPI-G14与anti-SIGLEC-15抗体偶联，靶向破骨细胞或癌症细胞，分别抑制CTSK和CTSL。通过质谱和western blot证明了CTSS-APIC复合物在体外的形成，说明NNPI不需要从抗体中释放来结合CTSS。作者还通过设计荧光探针证明APIC可以和靶向细胞表面的受体结合，然后被细胞内吞，并在溶酶体中降解并抑制组织蛋白酶的活性。在活细胞实验中，APIC可以导致组织蛋白酶底物，伴侣蛋白CD74的积累。在小鼠CD8+ T细胞和淋巴瘤细胞的共培养实验中，CTSS活性的丧失和CD74的积累将导致抗原呈递的改变，从而允许CD8+细胞毒性T细胞识别肿瘤细胞并激活抗肿瘤反应。并发现APIC可以阻碍乳腺癌细胞的迁移。在使用人类癌细胞的临床前小鼠肿瘤模型中，作者可以特异性地将APICs传递到肿瘤并抑制靶标活性，并使CD8+ T细胞增加。
总之，作者利用基于抗体的平台，通过特异性抗体-NNPI的组合靶向不同的组织蛋白酶，可以在不同的肿瘤类型中引发治疗性抗肿瘤反应。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01627-z文章引用：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01627-z
