生物膜不仅将细胞和细胞器从周围环境中分离出来，而且控制着细胞的各种功能，包括细胞形态形成、动力、物质交换和信号转导。最近的研究强调了脂质组织和膜蛋白对膜功能的重要性。脂质功能的机制在临床应用中也引起了广泛关注，因为与脂质生物合成相关的基因缺陷可能导致遗传性疾病 脂代谢的明显改变促进了癌细胞的生长和肿瘤的发生。
在这项研究中，作者介绍了一种溶剂致色性荧光细胞膜探针，具有光稳定性和低毒性，可实现长时间（>60min）的连续观察。在分子设计中，引入了不与细胞组织发生反应的芳香酯，确保化学稳定性和非侵入性。芳香酯的光稳定性可以通过使用能级图等光物理过程解释，类似于Prodan衍生物的方法。此外，作者已探索了通过微调其π-系统来抑制和操纵亚系统交叉和光降解的策略。
图1 溶剂致色性膜探针的研发和分子设计概念。a）溶剂致色性膜探针的历史发展。b）分子设计的概念图。黑色元素是光化学所需的，而红色元素是生物学所需的。
光物理特性
作者研究了新合成染料的光物理性质，如图2a所示。除了Prodan（芴和芘）和酮衍生物中使用的酯衍生物外，作者考虑了在分子的长轴方向上延伸π共轭的芴骨架，以增加偶极矩。酯衍生物的光物理性质与具有相同π电子骨架的乙酰/甲酰衍生物相当，并通过修改，创造了发射范围各异的强发光染料。在这些染料中，FCM、FπCMo-F、PCM、PCMst、FπCMst和FstCM的光物理性质优异，等同或超过了Prodan的性能。FstCMo-F发出约700nm的红光，并有望成为细胞膜探针。
图2 光谱特性。化学结构，吸收（虚线）和荧光（实线）光谱如下：a) FπCM, b) FπCMo-F, c) FπA, d) FCM, e) FR0, f) FstCMo-F, g) PCM, h) PCMst, i) PK, j) FπCMst 和 k) FstCM。蓝色网格区域表示Prodan的荧光范围。l) 对于FπCM，在固体晶体和非晶态状态的荧光光谱以及FπCM的单晶装填结构。灰色，白色，红色和蓝色球分别代表C，H，O和N。
光稳定性
作者通过在低极性溶剂（模型）中测量连续光照下存在氧气的光降解曲线以及在活细胞环境下评估了溶剂致色变染料的光稳定性。光稳定性在显微观察条件、观察对象和染料性质方面有很大差异。因此，并不适用于所有染料的标准评估方法。为了解决这个问题，作者选择甲苯作为溶剂进行测量，因为它的极性类似于细胞膜。FπCM、PK和Prodan的光降解曲线如图3a、b所示。所有酯化合物在经过3小时后仍保持超过94%的初始荧光强度，相比之下，它们的光稳定性要优于PK（86%）、Prodan（20%）和NR（76%），这些化合物通常用于需要高光稳定性的STED显微镜技术。
图3 a) FπCM、PK和Prodan在甲苯中氧气下的光降解曲线。激发波长（λex）为375 nm。b) 在甲苯中氧气下光照3小时后与初始荧光强度的荧光强度比较。A：FπCM，B：FstCMo-F，C：PK，D：Prodan，E：NR。c) 显示用FπCM染色的GUVs中的Ld和Lo相的共聚焦荧光图像。GUVs由DOPC（Ld）和DSPC/Cho（Lo）组成。d)模型膜中液态无序（Ld）和液态有序（Lo）相的示意图。还显示了发出不同波长荧光的染料。e) 用FπCM染色的EpH4的共聚焦图像。f)在细胞膜中随时间变化的FπCM、PK和Laurdan的光降解曲线。g) FπCM、Laurdan和PK在细胞膜中连续光照下的时间点成像。
接下来，作者检查FπCM是否能够检测模型膜和活细胞中的膜秩序。作为生物膜的模型，巨大单层囊泡（GUVs）被用FπCM染色，以评估其区分液态有序（Ld）和液态无序（Lo）相的能力，使用共聚焦显微镜。与在不同极性溶剂中的光谱性质一致（图2a），由DOPC组成的Ld相囊泡显示高的红色（>500 nm）/蓝色（<500 nm）比率，而由DSPC/Chol组成的Lo相囊泡显示低比率（图3c和3d）。活细胞内的膜秩序异质性如图3e所示，FπCM显示出EpH4小鼠上皮细胞、L-929和NIH3T3小鼠成纤维细胞以及人源HeLa细胞中饱和脂质、鞘脂质和胆固醇丰富的细胞表面质膜与富含不饱和脂质的内部细胞器之间的明显秩序差异（图4a），表明FπCM可以检测到无论细胞系还是宿主物种，细胞的膜异质性。这些结果表明，正如早期对PK所显示的那样，FπCM可以揭示细胞膜的秩序异质性。
图4 a) 上面，用1µM FπCM + 100nm NileRed或1µM PK染色的活HeLa细胞。红/蓝比和信号强度如图3c所示。下面，FπCM明亮颗粒与脂滴（NileRed）的共定位。b、c)在活细胞中同时观察溶剂致色性染料和荧光蛋白：b) 比较FπCM和PK对HeLa细胞分裂进程的影响。染色体形态与mCherry结合的H2B同时观察。c) 对间期细胞形态影响的比较。
因此，作者在活细胞的生理条件下比较了FπCM、PK和Laurdan的光稳定性。图3f展示了在EpH4细胞中连续光照射期间FπCM、PK和Laurdan的光降解曲线。与在甲苯溶剂中的光降解曲线相比，PK在测量开始时失去了大部分荧光。这可能除了光降解外，与活细胞中底物反应导致的荧光单元修饰有关。Laurdan和PK分别仅保持了约30%和10%的初始荧光强度，而FπCM保持了约80%。表明FπCM对各种设备的激光光强具有抵抗力。
生物成像应用
作者研究了光稳定膜探针FπCM相对于PK在活细胞时间序列观察中的优势（图4）。FπCM和PK都显示出HeLa细胞膜的有序异质性（图4a
