为大家分享一篇发表在Science上的文章，文章的题目是“Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues”，文章的通讯作者是来自Harvard MIT Broad Institute的David R. Liu、Amit Choudhary，主要开展基因编辑相关的研究；以及来自Dana-Farber癌症研究院的Eric S. Fischer，主要进行结构生物学和泛素酶体相关的研究。
分子胶是一种小分子诱导蛋白靶向降解技术，例如沙利度胺及其类似物代表的免疫调节药物（IMiDs）可以结合CRBN，从而招募CRL4CRBN E3泛素连接酶。IMiDs结合的CRBN识别锌指（ZF）转录因子中的β转角（β-turn）motif，因此将β-turn motif（通常称为degron）融合在其他蛋白上即可实现靶向降解。但当前IMiDs具有一定的脱靶效应，限制了其进一步发展。理想的degron应当具有序列短小、可被细胞通透性好的小分子识别、无脱靶响应等特点。因此在本文中作者开发了一种噬菌体辅助的连续进化系统（PACE），用于得到小的ZF motif，重新编程分子胶复合物。用于筛选的M13噬菌体包含3个质粒，SP（selection phage）包含使用待进化基因替换噬菌体外壳蛋白pIII基因gIII的噬菌体全套基因，AP（accessory plasmid）用于当分子胶存在活性时提供pIII，MP（mutagenesis plasmid）包含提高SP突变概率的一系列蛋白。选择压力为连续（PACE）或者定期（PANCE）加入新鲜宿主细胞稀释。在双杂交系统中，作者首先构建了一个验证系统：FKBP12被融合在DNA结合蛋白RR69，锚定在启动子pLac*的上游，当Rapamycin加入后招募FBP形成二聚系统，FBP则与大肠杆菌RNA聚合酶RNAP的小ω亚基融合，RNAP被招募到pLac*从而驱动下游gIII或荧光素酶报告基因luxAB的表达。初步结果显示rapamycin加入1小时后产生明显报告信号，表明该系统可行。因此作者随后基于此构建了分子胶和待进化蛋白的筛选双杂交系统。作者随后选择了合适的IMiD分子用于筛选，作者团队近期合成了一系列使用邻苯二甲酰亚胺取代的IMiDs，在其中作者选择了PT-179作为潜在的候选物。作者首先通过无偏的蛋白质组和转录组评估了PT-179的脱靶效应，结果显示PT-179处理后仅有3个表达差异的基因，具有非常少的内源性底物。作者随后将PT-179用于MG-PACE回路筛选。作为起始ZF，作者选择了一个由IMiD底物IKZF1和ZFP91组成的60AA嵌合体，称为SD0。在CRBN部分，作者首先使用CRBN CTD用于前期筛选，这是由于作者发现全长CRBN在大肠杆菌中的表达受到了限制。通过前期筛选作者初步筛选到了SD8序列，随后作者将其进一步送入全长CRBN的PANCE中筛选，并换用结合力稍弱的PK-1016替代PT-179，用于提高选择的严格性，借此作者得到了SD35。为了排除PK-1016不依赖CRBN的情况，作者最后设计了负选择系统，将gIII-negtive基因作为报告基因，并最终得到了SD36。得到SD36后作者随后在活细胞中进行了验证，同时考虑到SD36的突变发生在degron的中心，因此作者截断了SD36的N端和C端得到了“最小”的degron——SD40。作者还使用双引物编辑twinPE将SD40敲入293T细胞内源PLK1中，实现显著的PLK1敲低效果。最后作者还将该系统进一步用于筛选小鼠CRBN的degron，并最终得到了SD56变体。综上所述，在本文中作者使用噬菌体辅助的连续进化系统，筛选了脱靶效应更低的IMiD PT-179的degron，为分子胶领域提供了新的工具。原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk4422原文引用：10.1126/science.adk4422
