分享一篇发表在 JACS 上的文章，题目为“CytoDirect: A Nucleic Acid Nanodevice for Specific and Efficient Delivery of Functional Payloads to the Cytoplasm”。
将化疗药物、siRNA或小分子抑制剂等功能性有效载荷直接有效地递送到细胞质中，绕过内切酶/溶酶体捕获，是胞内递药的一项挑战性任务。本文章中，作者利用DNA纳米技术的可编程性开发了一种名为CytoDirect的DNA纳米装置，该装置将二硫单元和人类表皮生长因子受体2 (HER2)的粘附体整合到DNA折纸纳米结构中，使细胞质快速摄取到靶向癌细胞并渗透到深层组织中。作者进一步证明了治疗性寡核苷酸和小分子化疗药物可以很容易地通过CytoDirect传递，并分别对基因敲低和细胞凋亡有显著的影响。本研究证明了二硫化物和HER2修饰对DNA折纸及其有效载荷到靶细胞和深部组织的快速胞质递送的协同作用，从而扩大了DNA纳米结构的递送能力，为疾病治疗开辟了新的方向。
首先，作者合成了一个由7249个核苷酸组成的尺寸为90 nm × 60 nm × 2 nm的DNA折纸纳米片DON，通过引入了适当的内曲率使纳米片弯折来让药物更好地装载于纳米片内侧。作者使用亚磷酰胺化学在单链DNA的5’端引入了6个重复序列的侧链含二硫化叔丁基(6SS)的聚磷酸酯，命名为6SS-DNA；作者合成了一段5’端含氨基修饰的单链DNA，通过胺-巯基交联剂Sulfo-SMCC将含有巯基的HER2亲和体与单链DNA偶联，得到affibody-DNA，在体系中引入HER2亲和体。6SS-DNA与affibody-DNA通过与DON上的悬挂DNA单链互补配对从而同时负载上。最终，TEM结果表明（图2c），大多数don呈矩形形态，约15%呈管状结构。经过二硫修饰后，由于叔丁基保护基团在DON的二硫基团上引入的疏水效应，所有DON都呈现管状形状。这种形态可以在一定程度上保护管状结构内的有效载荷，疏水效应也可以通过增加细胞膜和CytoDirect之间的相互作用来增强细胞摄取。
图2.CytoDirect DNA纳米载体的设计与表征
接下来，作者利用表达不同水平HER2蛋白的乳腺癌细胞系（SK-BR-3和MCF-7，分别为HER2阳性和阴性）来研究CytoDirect的靶向能力。利用荧光素（FAM）标记了DON，以跟踪其位置。结果表明，当每个DNA折纸上负载约3个HER2亲和体后，可靶向HER2过表达细胞，并且与是否含二硫结构无关（图3a）。只有HER2亲和体修饰的DNA折纸HAF-DON和CytoDirect都可以靶向SK-BR-3，但是无法与MCF-7结合。而仅二硫修饰的DS-DON难以与SK-BR-3和MCF-7结合（图3b、3c）。
图3.CytoDirect靶向递送
接着，作者使用CLSM和流式细胞术定性和定量地证明了CytoDirect细胞摄取效率。CytoDirect会随着孵育时间延长而进入细胞质内，而未修饰二硫的DNA折纸HAF-DON则只会黏附在细胞表面（图a）。并且CytoDirect在进入细胞后，荧光分布均匀，表明载体不容易被溶酶体捕获（图4a）。在这个实验中，FAM是标记在6SS-DNA上，为了证明是整个纳米载体被细胞摄取，而不是仅6SS-DNA被摄取，作者用Alexa Fluor 647标记了DNA折纸的其他Staple链（图4b），结果与之前一致，表明CytoDirect具有更高的细胞摄取效率。二硫修饰和HER2粘附体协同增强细胞质摄取，细胞摄取的改善归因于靶诱导的加速二硫交换反应。因此，作者推测了CytoDirect细胞摄取具有四阶段：第一阶段:靶向HER2蛋白与表面膜结合;第二阶段:邻近诱导的有效二硫交换;第三阶段:直接转移到细胞质;第四阶段:谷氨酰胺辅助纳米载体从细胞膜释放（图4c）。
图4.CytoDirect细胞摄取
另外，作者检测了不同修饰的FAM标记DNA纳米载体的细胞分布来确定CytoDirect的细胞摄取方式。SK-BR-3细胞经3 nM CytoDirect、HAF-DON和DS-DON(绿色)处理5小时后通过共聚焦显微镜观察（图5）。细胞核用Hoechst 33342
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