今天分享的是ACS Catalysis上2019年6月Heather J. Kulik的文章: The Protein’s Role in Substrate Positioning and Reactivity for Biosynthetic Enzyme Complexes: The Case of SyrB2/SyrB1

单核非血红素铁(non-heme iron)酶由于可以选择性官能团化惰性碳氢键而吸引了广泛注意，在医疗相关天然产物的生物合成路径中是重要角色。非血红素铁酶的蛋白背景将铁活性中心深埋，通过底物递送部分控制专一性。SyrB2是这类酶中的一例，是Fe/α-ketoglutarate(αKG)-dependent halogenase (铁/α-酮戊二酸依赖卤化酶)，铁(II)中心被两个His、Cl和αKG配位。酰基携带蛋白(Acyl carrier protein, ACP) SyrB1的prosthetic phosphopantetheine (PPant)臂将底物递送并活化SyrB2，SyrB2氯化天然底物L-Thr的C4。SyrB2类的卤化酶与被深入研究的非血红素铁羟化酶在结构和机理上相似。卤化酶和羟化酶都通过Fe(IV)=O中间体实现氢攫取和随后的卤化或羟化。羟化酶中2His/1Asp(Glu)对羟化至关重要；卤化酶中Asp被Ala或Gly置换促使Cl与金属中心结合。

与Thr不同的非天然底物，如氨基丁酸(Aba)和norvaline(Nva)也可以被连接到SyrB1/PPant上，反应活性上这些非天然底物被攫氢的速率快130倍，但羟化产物增加(图1)。因此，SyrB2对天然底物卤化时有一种“底物专一的低效”。

图1 SyrB2/SyrB1复合物催化Thr, Aba和Nva氯化

理解SyrB2以及蛋白复合物对底物选择性的影响是充满挑战的：SyrB2的晶体结构中没有明显的底物递送通道，SyrB1的晶体还未得到。计算模拟可以在未完成结构解析时为蛋白间暂态相互作用提供洞见，然而目前SyrB2的计算模拟都是基于团簇模型的。

Silakov和同事最近效仿前人对非血红素铁羟化酶的机理研究，通过HYSCORE(hyperfine sublevel correlation spectroscopy)估算了PPant所携带底物的甲基、亚甲基和羟亚甲基碳到蛋白催化中心铁原子的距离。HYSCORE研究为分子模拟研究提出的SyrB2酶催化活性受底物定位的影响(Thr比非天然底物Aba和Nva到铁中心距离远)提供了实验基础。

SyrB2蛋白质背景在赋予专一底物活性中的角色仍旧未知，本文中我们用长时间经典分子动力学(MD)和大尺度QM/MM研究蛋白-蛋白和蛋白-底物作用对反应活性和选择性的影响。模拟提供了Thr, Nva和Aba底物不同朝向的细节。这些数据揭示了SyrB2定位底物和影响反应活性的蛋白-底物作用。本文对其他蛋白复合物活性位点作用研究也有帮助。

未形成复合物的自由SyrB1和SyrB2蛋白动力学：

SyrB1属于ACP蛋白家族，包含腺苷化(A)和巯基化(T)两个结构域，T结构域通过PPant臂实现底物递送，其中PPant臂通过磷酸化SyrB1的Ser与SyrB1蛋白相连，同时与底物Thr等形成硫酯来捕获底物。虽然SyrB1还未得到晶体，但由于ACP T结构域的保守性，作者通过同源模建获取SyrB1结构，该结构在500ns分子模拟中保持稳定。溶液中，PPant-S-Thr臂构象空间十分宽阔。通过定义回转半径(Rg, gyration, 磷酸到Thr末端碳距离)，作者发现PPant臂构象Rg在4埃位置有峰值，同时在3.5至7埃范围内均有构象存在(图2a,蓝色)。在Rg最小的构象中，PPant臂卷曲自己以缩小溶剂暴露表面积；Rg最大的构象是舒展的、近乎直线的。此处的分子模拟揭示PPant经常采取卷曲构象，但也可以通过约1.5 kcal/mol的能垒舒展为自由能上稍高约0.5 kcal/mol的直线构象，这一构象可以伸展到SyrB2的活性空腔中。分子模拟的结果在类似PPant的核磁数据中得到了验证。

与自由的SyrB1不同，被对接到SyrB2的PPant臂只能采取相当窄的构象分布(图2a,浅绿色)，其Rg大约为6.7埃，SyrB2中的PPant臂构象与自由PPant的舒展构象一致。

图2 (a)携带Thr的PPant Rg的归一化直方图，分别衡量了自由的SyrB1(蓝色)和SyrB2/SyrB1复合物(绿色)，并加入了代表性构象。(b) 对接得到的SyrB2/SyrB1复合物，F196和活性位点是stick风格。

SyrB2的晶体结构中没有明显的底物递送通道，但曾有假设指出苯丙氨酸残基F196的旋转可以引导底物递送，但自由能上F196附近残基是否允许这种转动仍然未知。这里作者通过长时间MD和伞取样来定量底物递送时蛋白的构象变化。作者定义了F196的二面角ksi1和ksi2来研究其旋转自由能面(图3下左下角)。

图3 (上) SyrB2中连接活性位点和溶剂环境的空腔，1左端红色：闭合结构能量最小点；2中间蓝色：敞开结构能量最小点；3右端绿色：SyrB2/SyrB1复合物结构能量最小点。与Fe(II)配位的残基是stick和sphere风格，F196残基门是stick风格

(中)  闭合、敞开和复合物的空腔半径分布归一化直方图

(下) F196关于二面角 ksi1和ksi22的自由能面，白色点对应晶体结构，敞开结构中的F196处于自由能面左侧局域极小点

作者运行了1.6μs的SyrB2晶体结构以及九个F196旋转异构体的分子模拟，其中六个只在F196晶体构象的附近运动(图4)，其他四个则获得了几种不同F196旋转异构体，其相互转化时间是数纳秒。

图4 以10个F196旋转异构体为起点的分子模拟所采得的构象，X处是起始构象

随后作者绘制了基于ksi1和ksi2的自由能面(图3下)，晶体结构恰好处于全局最小点，但另一局域最小点也很鲜明，两最小点通过大约2.5 kcal/mol的自由能能垒相连。

作者通过空腔分析验证了另一局域最小点是否属于SyrB2用于接收底物的敞开构象，空腔分析发现晶体结构中F196附近的空腔半径仅有1.2埃，局域最小点对应空腔半径为2.5埃，因此可以认为纳秒级的F196旋转实现了底物递送。

SyrB1和SyrB2的界面相互作用和动力学：

将SyrB1对接到SyrB2的敞开构象得到的结构在长时间分子模拟中保持稳定，两蛋白的质心距离没有明显增加，经典能量分解分析(如GBSA)发现一些关键蛋白-蛋白作用用来稳定复合物。有利作用主要是出现在SyrB1和SyrB2交界的柔性环区和小螺旋附近，比如SyrB1 D589和SyrB2 D58的盐桥，这些作用将有助于通过突变实验设计长寿命复合物。

PPant臂与SyrB2的有利作用也被揭示，如磷酸基与N184的氢键，与F195和F196的范德华作用。PPant羟基和E111的氢键作用占据了70%以上的MD快照。

图5 PPant与周围SyrB2残基关键氢键、堆积和静电作用的图示

HYSCORE实验与蛋白-底物相互作用：

HYSCORE实验中使用与铁催化中心结合的NO作为EPR探针，揭示了Thr相对与非天然底物与铁的距离更远(Thr, 4.2±0.3埃；Nva, 3.4±0.3埃；Aba, 3.7±0.3埃)，底物与Fe-N键成锐角(Thr/Aba 85±10°，Nva 64±7°)，如图6。

图6 HYSCORE实验测得的底物和蛋白质复合物的结构信息

作者试图通过分子模拟重现这些几何信息，考虑到NO与铁的配位有三种可能(图7)，因此对于任一种底物都要模拟三种配位异构体。然而基于经典力场的分子动力学未能重现图6中的几何参数，作者认为是经典分子力场不能得到包含短距离非共价作用的构象，因此作者基于HYSCORE实验参数运行Restrained MD，来获得蛋白与底物的关键相互作用。

图7 NO作为探针与铁催化中心结合后可能的配位异构体

加入限制力后的分子模拟结果中没有出现明显的异常键长键角，在三种NO配位异构体中都重现了HYSCORE实验观察到的键长键角趋势(图8)。作者观察到Restrained MD中带电残基对整体作用的贡献与中性残基与底物作用相当，然而未加限制力的MD中带电残基与底物的作用在蛋白-底物作用中占主导，作者认为这是经典分子力场的点电荷模型导致的计算假象。随后作者通过化学经验排除了eq和ax-αKG两种异构体，专注于与晶体结构更加相似的ax异构体的分析。

图8 上 在三种NO配位异构体中HYSCORE测量的键长(Fe-Me/Mt)和键角(Fe-N-Me)

下 实验测得的键长键角以及误差由椭圆形区域表示，Restrained MD计算得到的键长键角由圆圈、方框和三角及其穿过的线段分别表示均值和误差

作者发现Fe-Me和Fe-Mt键长与底物进入酶活性空腔的深度有关(图9)，天然底物Thr相对于Nva和Aba进入空腔的深度更大，因此其Fe-Me和Fe-Mt键长更长。

更长

图9 Thr, Nva和Aba在底物递送时进入SyrB2的深度，作者观察SyrB2蛋白结构选定了两个相对静止的残基B11和B12，通过测量底物甲基C和氨基N到B11和B12的距离差来衡量底物进入SyrB2空腔的深度，数值越小表示越深。

曾有假设认为底物和位点专一的羟基化/卤化产物比例由底物定位决定，即与Fe(IV)=O中间体距离次优的构象导致氯化而不是羟基化。由于HYSCORE实验中NO占据了铁配体OH的位置，Restrained MD给出的C-N距离可以认为是被活化C到OH距离，图10展示了三种底物中C-N和C-Cl距离的分布，其中Nva的C4也可能被官能化，可以看出C-N距离Nva远小于Aba和Thr，但三者C-Cl距离几乎相同。Nva C4的官能团化速率以及羟基化/氯化产物分布与Aba结果相似，从图中Aba和Nva C4灰色轮廓线的大致重合可以推知这一点。总之作者认为天然底物Thr“底物专一的低效”源于Thr相对于Nva和Aba距高价铁氧中间体的距离远，而不是与Cl距离近。

图10 左：ax异构体中C-N和C-Cl距离的分布，其中灰色轮廓线代表Nva的C4

右：三种底物的代表性构象

蛋白-底物的氢键：

虽然作者用Restrained MD重现了HYSCORE观测的几何参数，但作者仍打算在QM/MM水平探索催化位点的结构。最后作者发现50个QM/MM结构优化构象与HYSCORE几何参数接近。

随后作者用BCP(Bond critical point)分析了蛋白-底物的氢键，Thr与N123形成两个强度分别为-7.2 kcal/mol和 -5.2 kcal/mol的氢键(图11)；Aba只与N123形成一个强度为-6.9 kcal/mol的氢键，由于Aba缺乏另一个氢键的束缚，其甲基倾向于靠近铁中心；Nva与Aba情况类似，只形成一个氢键。

图11 Thr(a)和Aba(b)与N123形成的氢键的BCP点及其强度

QM/MM优化Thr与N123的单一氢键结合结构不能得到双氢键构象，说明单/双氢键的构象转化间存在能垒。随后作者通过经典分子力场的构象采样发现分子力场水平也存在双氢键构象，但由于精确度有限，分子力场下的双氢键构象比单一氢键构象能量稍高(图12)。

图12 经典分子动力学采样得到的氢键结合能量变化

接下来作者用只含活性空腔残基的团簇模型量化优化了底物与关键残基的氢键，Nva和Aba在关键残基不固定时可形成多个强氢键，然而根据蛋白骨架位置固定关键残基后，量化优化的团簇模型只给出单氢键构象，说明蛋白骨架在非天然底物定位中对氢键数量有显著影响。

作者总结到：蛋白背景为天然底物Thr提供双氢键，稳定化能超过21kcal/mol；然而非天然底物只有一个氢键，稳定化能约15 kcal/mol。双氢键作用固定底物，使其远离铁中心(图13)。

图13 单/双氢键模型对底物定位的影响

基于上述讨论，作者期待N123的突变可以显著影响天然底物的氯化效率，回顾文献也发现突变体N123A/N123Q使活性降低到26-30%。另外作者认为另一种有晶体结构的卤化酶WeIO5也可以通过本文的流程分析其底物-蛋白作用。

总结：

作者确认了F196旋转打开底物递送通道，SyrB1和SyrB2接触面残基重新排布进一步打开通道；尽管自由的SyrB1 PPant臂采取卷曲构象，但可以为底物递送异构化为直线构象，SyrB1/SyrB2复合物中PPant臂直线构象的运动被关键残基间的作用限制。

SyrB1/SyrB2复合物的无限制力经典动力学没有重现HYSCORE给出的几何信息，施加限制力后得到了预期结果。从Restrained MD结果中作者发现了天然底物Thr与N123形成两个氢键，而非天然底物只有一个氢键，使非天然底物的运动受限程度降低，从而亲近了铁中心。相对于Nva和Aba，Thr被SyrB1递送到SyrB2更深处。三种底物的C-Cl距离相似，Thr C-O距离比Nva和Aba长。

不仅仅局限于SyrB1/SyrB2，作者认为他们开发的Protocol可以扩展到其他ACP递送底物的过程，谱学指导的MD也不失为一种准确刻画蛋白-底物和蛋白间相互作用的方法。