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Anal. Chem.|基于共价有机框架和酶催化信号放大的电化学免疫传感器检测心肌肌钙蛋白 I
今天跟大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章,文章题目是Electrochemical Immunosensor for Cardiac Troponin I Detection Based on Covalent Organic Framework and Enzyme-Catalyzed Signal Amplification”,本文的通讯作者是来自中国科学技术大学的杨秀荣院士,主要从事电分析化学、分子识别和生物分子相互作用及微流控分析化学的研究。本文提出了一种使用多功能共价有机骨架纳米复合材料(HRP-Ab2-Au-COF)作为信号放大探针的高灵敏度电化学免疫传感器,用于测定心肌肌钙蛋白 I(cTnI)。提供了一种简单的方法来定量测定实际样品中的 cTnI,并拓宽了基于 COF 的纳米复合材料在电化学免疫传感器中的应用范围。

急性心肌梗死(AMI)是冠心病中最严重的一种,对人类健康造成严重威胁。迄今为止,肌酸激酶-MB、肌红蛋白、C反应蛋白和cTnI是诊断AMI的有价值的生物标志物。其中,cTnI是临床应用中特异性最强、窗口期最长的生物标志物,被认为是AMI诊断的金标准。因此,开发一种快速灵敏的分析方法来检测 cTnI 至关重要。
基于抗原和抗体之间高特异性鉴定的免疫学检测是生物标志物定性和定量检测的重要分析方法。目前,许多基于酶联免疫吸附测定的免疫测定方法,如化学发光免疫测定法、荧光法、表面增强拉曼散射法和比色法,已应用于cTnI检测。与上述方法相比,电化学免疫传感器以其响应速度快、选择性强、灵敏度高、操作简单等优点引起了人们的广泛关注。近年来,各种纳米材料已被用于设计 cTnI 电化学免疫传感器以提高检测灵敏度。因此,设计新型功能纳米材料并构建电化学免疫传感器以快速、选择性和灵敏地测定 cTnI 具有重要意义和紧迫性。
共价有机骨架(COF)是一种通过共价键将有机结构单元连接在一起,形成具有周期性结构的多孔结晶骨架的材料。它具有比表面积大、孔径可调、孔隙率高、毒性低、生物相容性好等诸多独特优点。因此,COFs 已被用于许多研究领域,如药物递送、分离、催化、气体吸附和储存等。近年来,具有独特多孔、电子和机械性能的 COFs 已与其他电活性材料一起功能化,以设计各种信号放大策略以提高电化学免疫传感器的分析性能。然而,基于 COF 的 cTnI 电化学免疫传感器的开发仍处于起步阶段。
基于上述背景,设计了一种基于COF的信号探针,首次用于cTnI的夹心式电化学免疫分析。构建的电化学信号探针HRP-Ab2-Au-COF集靶点识别和信号放大功能于一体,COF表面负载的金纳米粒子增强了电导率,促进了抗体(Ab2)的结合。当引入目标 cTnI 时,HRP-Ab2-Au-COF 通过抗体-抗原相互作用固定在电极表面,其中 H2O2-HRP 系统催化氧化氢醌 (HQ) 生成苯醌 (BQ),然后进一步还原生成苯醌 (BQ)电化学信号。该生物传感器对 cTnI 具有良好的分析性能,检测限为 1.7 pg/mL,在实际样品中的检测结果令人满意,表明其在临床分析中目标蛋白的测定方面具有突出的应用前景。

方案1简要说明了HRP-Ab2-Au-COF的制备过程和电化学免疫传感器的组装过程。首先,通过简单的液相合成方法在室温下由 TAPB 和 DMTP 制备球形 COF,在 NaBH4 通过 Au-NH2 结合还原的情况下,金纳米粒子在 COF 表面原位生长。然后,Ab2 通过 Au-NH2 反应与金纳米粒子结合。之后,HRP 通过主客体相互作用嵌入 COF 的孔中。值得注意的是,COF 在连接金纳米粒子、Ab2 和 HRP 方面发挥了重要作用。此外,金纳米粒子具有优异的导电性,可以提高生物传感器的灵敏度。由于COF的高孔隙率,大量的HRP分子被引入到纳米复合材料中,实现了标签从一对一到一对多的转化模式。HRP与Ab2标记的COF结合,可同时实现目标识别和信号放大。为了检测 cTnI,首先通过 Au-NH2 结合将捕获抗体 Ab1 固定在裸 GE 的表面。用 BSA 封闭多余的活性位点后,修饰电极与不同浓度的 cTnI 孵育。最后,制备的 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶联物被 cTnI 捕获。将修饰电极浸入电解液中后,H2O2 可以有效地将 HRP 氧化为 HRPOx,进而将 HQ 氧化为 BQ 并再生 HRPRed。接下来,BQ 在电极表面周围被还原并产生明显的电化学信号。通过这种 H2O2-HRP-HQ 催化循环,可以获得放大的电流信号,并将设计的生物传感器应用于 cTnI 的定量检测。

SEM 和 TEM 用于表征 COF 材料的形态。COF 显示出均匀的球形形态,表面粗糙(图 A、B)。在 COF 上原位生长的金纳米粒子大小约为 2.5 nm,分布均匀(图 D、F)。值得注意的是,在金纳米粒子生长和负载蛋白质后,Au-COF 和 HRP-Ab2-Au-COF 的形态(图 C-F)与 COF 相比保持不变。然而,与 COF (294.1 nm) 相比,Au-COF 和 HRP-Ab2-Au-COF 的流体动力学尺寸分别逐渐增加至 336.6 和 423.7 nm。COF 的 BET 表面积计算为 386.7 m2/g。此外,根据 NLDFT 分析,COF 的孔体积和平均孔径分别约为 0.56 cm3/g 和 2.88 nm。

HRP-Ab2-Au-COF 的元素映射显示 Au 和 Fe 的均匀分散(图 A),表明 Au 纳米颗粒和 HRP 成功与 COF 结合。Au 4f 的 XPS 光谱如图 B 所示。84.17 和 87.82 eV 的两个峰分别归因于 Au 4f7/2 和 4f5/2。根据 ICP-OES 结果,Au 和 Fe 的含量分别约为 7.62% 和 0.063%。以上分析结果均证实了HRP-Ab2-Au-COF纳米复合材料的成功合成。

为了确保传感方法的可行性,进行了 CV 和 EIS 实验来研究电极修改程序。如图 A 所示,裸 GE 显示出一个非常小的半圆,这证明了其出色的导电性。固定Ab1,用BSA封闭,捕获cTnI后,电荷转移电阻(Rct)依次增加,这是由于非电活性蛋白质抑制了电子转移。随后,在与 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶联物结合后,Rct 进一步增加。此外,在没有 cTnI 的情况下,与 HRP-Ab2-Au-COF 孵育的修饰电极显示出与 BSA/Ab1/GE 相似的 Rct(曲线 d),表明可忽略不计的 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶联物非特异性吸附在电极表面。图 B 中相应的 CV 曲线显示,在逐步修改 Ab1、BSA、cTnI 和 HRP-Ab2-Au-COF 后,峰值电流降低,峰间分离度增加,这与 EIS 的结果一致。此外,图 C 显示了所提出的电化学生物传感器在含有 HQ 和 H2O2 的 PBSI 溶液中有或没有目标 cTnI 的 DPV 曲线。在没有 cTnI 的情况下,生物传感器在 -0.064 V 处显示出很小的电流响应。然而,随着 1 ng/mL 目标 cTnI 的加入,由于 H2O2-HRP-HQ 介导的信号放大,电流显着增加了 4.6 倍.这些结果证明了所提出的生物传感器的成功组装和可行性。

在最佳实验条件下,通过测量 DPV 响应电流来研究 cTnI 的浓度。从图 6A、B 中可以看出,生物传感器的 DPV 电流信号随着 cTnI 浓度的增加而增强。响应电流在5 pg/mL~10 ng/mL范围内与cTnI浓度的对数呈线性关系,相关系数为0.9918。同时,计算出的检测限为 1.7 pg/mL (S/N = 3)。在临床研究中,cTnI 浓度在 0.5 至 2.0 ng/mL 之间被视为正常人和患者的分界线。因此,该方法可用于检测实际样品中的 cTnI。 
总之,构建了一个基于COF的电化学生物传感平台用于cTnI的定量测定。鉴于高孔隙率的优势,大量的HRP被封装在COF中,可以在H2O2的帮助下有效地促进HQ氧化为BQ,进而显着放大BQ的电化学还原信号。同时,COF良好的生物相容性可以保持酶的活性和稳定性。此外,在 COF 表面原位生长的金纳米粒子不仅有利于 Ab2 的固定,而且还提高了电导率。结合上述优点,设计的电化学生物传感器检测 cTnI 的线性范围为 5 pg/mL 至 10 ng/mL,检测限为 1.7 pg/mL,并表现出优异的选择性和重现性。所提出的免疫传感器成功地用于实际样品测定,显示出良好的回收率和重现性。总之,我们构建的基于 COF 的电化学免疫传感器可以成为检测其他生物标志物的通用方法。


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