基于适配体识别与糖代谢标记的外泌体特定蛋白糖基化原位成像和生物学功能研究-上海纳孚生物科技有限公司

网站首页/有机动态/有机干货/Angew. Chem. Int. Ed.: 基于适配体识别与糖代谢标记的外泌体特定蛋白糖基化原位成像和生物学功能研究

有机动态

有机前沿

有机干货

实验与测试

有机试剂

化学试剂

新材料产品

Angew. Chem. Int. Ed.: 基于适配体识别与糖代谢标记的外泌体特定蛋白糖基化原位成像和生物学功能研究

引言

外泌体糖蛋白参与许多关键的生理和病理过程，如信号传递、免疫抑制以及肿瘤转移等。外泌体蛋白的糖基化定义了相关蛋白的功能，进而决定了外泌体在细胞交流中的信号传导特性。因此外泌体蛋白糖基化的表征对于外泌体的进一步生物应用是十分必要的。此前研究外泌体蛋白糖基化的策略如凝集素法和质谱法等，需要从外泌体释放靶标蛋白，不能保证外泌体的完整性，因此不适用于生理状态下外泌体蛋白糖基化的研究。糖代谢标记（MGL）法可通过细胞培养和随后的化学偶联将化学功能基团转移到细胞膜多糖中，从而不显著影响细胞的完整性和功能。但到目前为止，MGL还未在外泌体蛋白糖基化的研究上得到应用。

成果简介

近期，厦门大学化学化工学院杨朝勇教授团队在《Angew. Chem. Int. Ed.》上发表了题为“Coupling Aptamer-based Protein Tagging with Metabolic Glycan Labeling for In Situ Visualization and Biological Function Study of Exosomal Protein-Specific Glycosylation”的研究论文。在该研究中他们开发了一种基于蛋白特异性适配体标签和糖代谢标记（ExoAp-MGL）的双标记策略来实现外泌体蛋白糖基化的原位可视化。他们选择外泌体程序性细胞死亡配体1（exoPD-L1）作为研究靶点，首先利用MGL对外泌体表面唾液酸进行糖代谢标记，接着利用点击化学反应引入DBCO-Cy5，用Cy3标记的PD-L1适配体对PD-L1进行识别。然后通过Cy5与Cy3之间的FRET信号实现对同一外泌体上蛋白糖基化的原位表征。

图文解读

示意图1. ExoAp-MGL 策略用于表征外泌体PD-L1（exoPD-L1）糖基化的示意图。 A) 细胞用Ac4ManNAz培养后分泌含有叠氮化唾液酸的外泌体。B) 炔基荧光染料DBCO-Cy5通过点击化学反应与叠氮唾液酸进行生物正交反应，对其进行标记。C) Cy3标记的PD-L1适配体用于PD-L1蛋白的识别。D) 利用Cy3标记的PD-L1适配体和DBCO-Cy5标记的唾液酸之间的荧光共振能量转移实现exoPD-L1的原位荧光成像。

图1. 代谢标记的A375人黑色素瘤细胞外泌体的鉴定以及PD-L1识别分子（适配体和和抗体）的结合特性表征。A) 糖代谢标记外泌体的透射电镜（TEM）表征。B) 代谢标记的外泌体尺寸数据。C) 抗体染色实验结果表明标准外泌体和代谢标记的外泌体具有相近的外泌体标志物CD63，以及免疫检查点PD-L1表达量。D) 免疫印迹实验对代谢标记的外泌体PD-L1表达量以及去糖基化的分析。以上结果说明糖代谢标记不会对外泌体的性质产生明显影响。E) PD-L1抗体与PD-L1适配体结合性能的流式细胞分析，说明MGL不影响抗体或适配体对PD-L1的识别。F) PD-L1适配体对exoPD-L1与PD-1相互作用的影响。

图2. exoPD-L1 糖基化的可视化。A) 叠氮化唾液酸外泌体与炔基荧光染料DBCO-Cy5的生物正交反应示意图。B) 用Ac4ManNaz处理/不处理的A375细胞与DBCO-Cy5孵育后外泌体的荧光强度，结果表明DBCO和叠氮化唾液酸外泌体的生物正交反应的成功进行。C) 共聚焦成像结果表明只有在DBCO-Cy5 和Cy3标记的PD-L1 适配体共孵育后才会有FRET信号，进一步验证了ExoAp-MGL策略的可行性。

图3. exoPD-L1糖基化对其与PD-1相互作用的影响。A) 代谢标记的糖基化和去糖基化外泌体先后用DBCO-Cy5和Cy3标记的PD-L1适配体标记，然后与PD-1受体共孵育后的原位共聚焦成像。B) 共聚焦成像中荧光强度的定量分析。C) PD-1染色的荧光信号与FRET信号的皮尔逊相关性分析。以上结果表明了糖基化是外泌体PD-L1与PD-1相互作用的结构基础，在两者相互作用中发挥着重要作用。

图4. exoPD-L1糖基化对CD8⁺ T细胞识别和抑制的影响。A) 代谢标记的外泌体用/不用PNG酶F处理，再用Cy3标记的PD-L1 适配体和DBCO-Cy5标记，并与CD8⁺T细胞共孵育后进行共聚焦成像，用eFluor450标记的CD8抗体鉴定CD8⁺T细胞。结果表明糖基化有利于PD-L1对PD-1表达的CD8⁺T细胞的识别。B) 代谢标记的糖基化/去糖基化外泌体与CD8⁺T细胞共孵育后细胞数量变化分析，说明exoPD-L1糖基化可能有助于抑制CD8⁺T细胞的增殖。C) exoPD-L1糖基化影响对CD8⁺T细胞识别和抑制其增殖的可能机理。

总结与展望

综上，作者开发了一种基于适配体识别和糖代谢标记的新型ExoAp-MGL双标记策略，用于外泌体蛋白的原位成像和功能研究。这是一种简单、高效且非破坏性的方法，不影响外泌体的完整性和生物活性，更适用于外泌体蛋白糖基化的生物学功能探究。并首次证明外泌体PD-L1的糖基化是外泌体PD-L1与PD-1识别的结构基础，且有助于抑制CD8⁺T细胞的增殖，可作为一种新的免疫治疗靶点。该方法也可进一步拓展到其他外泌体糖蛋白的研究。

作者简介

杨朝勇，国家杰出青年科学基金获得者、厦门大学特聘教授、上海交通大学分子医学研究院副院长、谱学分析与仪器教育部重点实验室副主任、中国化学会化学生物学专业委员会副主任、美国化学会ACS Applied Bio Materials 副主编。于2006年在美国佛罗里达大学获得博士学位，2006年9月至2007年12月在美国加州大学伯克利分校从事博士后研究。

主要研究领域未生物分析化学，在分子探针、微流控芯片、信号放大、单细胞分析等方向取得了创新性的成果。