近日，北京大学化学与分子工程学院王初课题组在Chemical Science杂志上在线发表题为"Chemical proteomic profiling of protein N-homocysteinylation with a thioester probe"的研究文章。

       高半胱氨酸是甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间体。在人体中，相关代谢酶的缺陷和营养元素的缺乏都会导致血液中总高半胱氨酸浓度的上升，高于15μmol/L即患有高同型半胱氨酸血症，目前的研究发现该病和许多血管疾病以及神经退行性疾病密切相关。血液中过量的高半胱氨酸会在甲硫氨酰tRNA合成酶的错误剪辑下转化成具有高化学反应活性的高半胱氨酸硫内酯。高半胱氨酸硫内酯可以与蛋白质的赖氨酸残基生成N-高半胱氨酰化修饰，该修饰是一种非酶催化的蛋白质翻译后修饰，可以引起蛋白质损伤，聚集和自身免疫应答，被认为是高同型半胱氨酸血症的一个重要致病因素。然而目前报道的检测方法包括高效液相色谱法，抗体法和醛基标记法，都受限于灵敏度，而且很难鉴定蛋白质和修饰位点。

       化学蛋白质组学的发展极大促进了生物体系中蛋白质翻译后修饰的鉴定。因此，结合本实验室在化学蛋白质组学方面的技术，我们发展了选择性标记N-高半胱氨酰化修饰的探针，并将其成功应用于复杂蛋白质组体系中。该课题设计灵感来自于蛋白质合成中广泛使用的自然化学连接方法，其改进策略之一甲硫氨酸连接法中使用的N端高半胱氨酸恰好与我们所研究的N-高半胱氨酰化修饰结构一致，因此，我们推测硫酯结构可以选择性的标记N-高半胱氨酰化修饰。

       首先我们合成了一系列炔基硫酯探针和N-高半胱氨酰化修饰类似物，在小分子反应中发现MPAA（对巯基苯乙酸）衍生化探针AT-3表现出最快的反应速率，其中MPAA是自然化学连接中常用的硫醇辅助剂。所以我们将AT-3应用于了后续的蛋白质标记实验中。由于生理条件下，硫酯可以和赖氨酸残基发生副反应，因此我们在单一蛋白质水平上对标记条件进行了优化，选择了pH 6环境中标记30min，在多个单一蛋白质上均具有很好的标记选择性。最后我们将该探针应用于了复杂蛋白质组中，结合同位素二甲基化标记策略，在invitro和in situ条件下鉴定了超过1000个可能蛋白质靶点，并进行了验证。对这些修饰靶点分析发现很多分布在细胞附着，翻译起始和蛋白质折叠等通路中，而且丰度较高。这与文献中报道该修饰与人血浆中蛋白质丰度成比例的结果相一致。最后，我们利用可光切除生物素标签对N-高半胱氨酰化修饰位点进行了准确鉴定，首次报道了304个高置信度的修饰位点，功能分析发现该修饰可能与赖氨酸上其它翻译后修饰，例如乙酰基化关系密切。

       尽管自然化学连接已经报道超过20年，但其应用仅仅局限于蛋白质合成中。我们的工作利用了N-高半胱氨酰化修饰的特殊结构，第一次将该化学拓展至了疾病相关的蛋白质翻译后修饰分析中。该方法的发展也将有助于揭示高同型半胱氨酸血症相关疾病的分子机制。本文通讯作者为北京大学化学与分子工程学院和北大-清华生命联合中心王初研究员，第一作者为北京大学化学与分子工程学院2013级博士研究生陈南，王初课题组本科生刘锦民，乔泽宇，博士后刘源对该工作的完成做出了贡献，同时北京大学医学部王宪教授，姜长涛教授和博士生杨越也参与合作。

原文链接：

http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2018/sc/c8sc00221e#!divAbstract

文章引用：
Nan Chen,Jinmin Liu, Zeyu Qiao, Yuan Liu, Yue Yang, Changtao Jiang, Xian Wang and ChuWang* Chem.Sci.,2018, Advance Article  DOI：10.1039/C8SC00221E