今天给大家推荐的是最近发表在Chemical Science上的一篇文章，题为“Secondary amine selective Petasis (SASP) bioconjugation”，通讯作者为奥本大学的Monika Raj。

位点特异的选择性修饰蛋白在生化分析、治疗、生物工程等领域有着广泛的应用。这样的合成需要很好的化学选择性甚至区域选择性生物偶联反应。常见的修饰方法有半胱氨酸残基的烷基化、基于非天然氨基酸的正交反应、自然化学连接、酶催化手段等等。针对N末端的特异性偶联，已报道的有基于半胱氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸的，也有通过调节pH特异性与N末端氨基反应的。但能够与二级胺选择性反应，或者说与脯氨酸特异性偶联的方法尚无报道。由于脯氨酸（pKa=10.6）在生理条件下比一级胺（pKa=9.5）反应活性弱，且与赖氨酸侧链（pKa=10.6）反应活性类似，脯氨酸的特异生物反应在化学上一度面临挑战。而本文报道的便是一种二级胺选择性Petasis反应，用于N末端脯氨酸特异性生物偶联。

图1. 选择性反应原理

这是一种多组分的二级胺选择性Petasis反应（图1），首先二级胺在水中的亲核性（N=17）比一级胺（N=12）更高，利用醛与二级胺反应生成更加亲电的亚胺离子，亚胺离子迅速与亲核性的有机金属硼酸盐反应得到产物。在一锅反应里，能迅速生成位点特异的产物，且该反应具有立体选择性（＞99% de）。

图2. 反应在三肽中的选择性

首先作者在三肽中进行了选择性验证（图2）。合成得到了20种三肽，XAF（X代表任何一个天然氨基酸）。将20种XAF分别与醛（2a）、硼酸盐（3a）在pH 7.3的磷酸盐缓冲液与DMF混合溶剂（4:1）中室温进行反应，LCMS检测发现仅有PAF发生了反应，反应程度70%。后将20种三肽混合，也仅有PAF发生了反应。体现了很好的化学选择性。在对立体选择性的研究中发现，与L-脯氨酸反应得到了的产物为R型，而与D-脯氨酸反应则得到S型（de＞99%）。

图3. 不同官能团底物

随后进行了反应优化。将PBA替换为水溶性更好的PMB，在pH 7.3的磷酸盐缓冲液与DMSO混合溶剂（4:1）中反应2h，程度可达到90%。针对PAF，发现其与SAL、PMB反应的产物在pH 6.5-9.5十分稳定，完全不水解；在不同pH下，pH高反应转化率更高，在7.3十五分钟转化62%，而9.5转化80%。生理条件下转化率也不差，因此后续反应也都在pH 7.3进行。对于其他不同官能团的底物也进行了尝试，多种产率都很高。

图4. 生物活性多肽的二级胺特异性反应

进一步，与包含赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链的寡肽PFKAFV、PFCAF反应，也仅有N末端的脯氨酸被修饰了，显示出高选择性。与具有生物活性的多肽反应，如血管紧缩素I（PDRVYIHPFHL），一种能够导致血管收缩血压升高的肽激素；缓激肽（PPGFSPFR），一种炎症调节因子；高海藻糖神经肽（PVNFSPGWGT）及胰岛素A链截取出来的多肽（PICSLYQLENYCN），均显示出很好的单一位点反应性。

图5. 蛋白的二级胺特异性反应

最后，在蛋白层面，与天然N末端无脯氨酸的肌红蛋白、α-乳清蛋白，以及N末端具有脯氨酸的醛缩酶、肌酸激酶反应，仅后者发生了反应，且从圆二色谱来看，该修饰对蛋白二级结构几乎未造成影响。

总的来说，本文发展了一种针对二级胺的生物偶联方法，在生理条件下可以对其进行双重标记，且该反应具有立体选择性，产物稳定，底物多样。

作 者：HYL 审 校：WH

Raj, M., et al., Chemical Science 2020, 11 (1), 53-61.

Link：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/SC/C9SC04697F