蛋白磷酸化是普遍存在的调节细胞信号转导的翻译后修饰。其中蛋白激酶催化真核蛋白底物中含羟基丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。蛋白激酶活性异常通常与包括癌症在内的疾病有关，因此是一类有效的药物靶标。表征激酶底物对于破译激酶信号传导的分子细节十分重要。但是激酶-底物相互作用的瞬时性质使得表征激酶底物具有困难，因此需要发展新的方法来全映射正常和患病状态下的细胞信号。近日，韦恩州立大学的Mary Kay H. Pflum课题组在《Angew. Chem. Int. Ed.》期刊上发表了题为“An Affinity-Based, Cysteine-Specific ATP Analog for Kinase-Catalyzed Crosslinking”的研究论文。在该研究中，作者报道了一种基于亲和力的交联ATP类似物ATP-甲基丙烯酰胺（ATP-MAc），其中包含一个半胱氨酸反应性丙烯酰胺交联基团，可避免紫外线辐射和现有类似物的非特异性反应性。在体外激酶测定法中，ATP-MAc充当激酶的共底物，仅在活性位点共价交联含有半胱氨酸的激酶。此外，ATP-MAc还能够在细胞裂解物溶液中交联细胞蛋白，具有基于细胞研究的相容性。
图1、（A）ATP和γ-磷酰基修饰的ATP类似物：ATP-芳基叠氮化物（ATP-ArN3）、ATP-二苯甲酮（ATP-BP）和ATP-甲基丙烯酰胺（ATP-MAc）的化学结构。（B）识别激酶-底物对的化学方法通常将瞬时激酶-底物相互作用转化为可以纯化和表征的稳定复合物。通过在通用的激酶共底物ATP的γ-磷酰基上修饰光交联剂（如ATP-ArN3或ATP-BP）可以开发光交联探针。在紫外线照射下，ATP-ArN3和ATP-BP以磷酸化依赖性方式将激酶共价连接至其底物，以促进激酶底物对的富集和鉴定。尽管ATP-ArN3和ATP-BP具有广泛的反应性和可诱导活化等优点，但存在非特异性交联和由于紫外线照射产生不良生物学效应等问题。（C）为了避免紫外线辐射，作者开发了基于亲和力的交联基团—具有半胱氨酸反应性的甲基丙烯酰胺交联基团ATP-MAc，当ATP-MAc修饰的γ-磷酰基被转移到激酶底物上时，在激酶活性位点的半胱氨酸与甲基丙烯酰胺基团之间的迈克尔加成将使激酶共价交联到其底物上。ATP-Mac无需紫外线照射，具有生理条件相容性以及半胱氨酸的特异性靶向性。
图2、（A）EGFR激酶结构域（蓝绿色）与ATP类似物活性构象的晶体结构（pdb 2GS6）。（B）ATP类似物的γ-磷酰基与EGFR活性位点最接近的半胱氨酸残基的硫之间的距离为8.4 Å。（使用PyMOL软件，原子的颜色编码为C =绿色，H =灰色，N =蓝色，O =红色，P =橙色，S =黄色。）
方案1、ATP-MAc 1和2的合成。通过将甲基丙烯酸酐与二胺4或5孵育以合成胺6或7。最终通过将胺6和7与ATP偶联而获得ATP-MAc 1和2。
图3、（A）通过荧光标记反应测试ATP-MAc 1和2在激酶催化的标记中的反应性。将双FITC-胱胺10与ATP-MAc 1或2、PKA激酶对髓磷脂碱性蛋白（MBP）底物进行荧光标记示意图。（B）通过SDS-PAGE分离及可视化。在ATP-MAc 1和2均存在的情况下，MBP被PKA和双FITC-胱胺10荧光标记（泳道4和6），没有PKA（泳道3和5）或带有星形孢菌素（泛激酶抑制剂）的反应未显示荧光标记（泳道7和8），证实了激酶的依赖性，表明，ATP-MAc 1和2是具备与甲基丙烯酰胺反应性的激酶共底物。（C）通过量化磷酸化程度来评估ATP-MAc 1和2作为共底物的效率。将ATP，ATP-MAc 1或ATP-MAc 2与PKA和MPB一起孵育，然后用酸裂解γ-磷酰基上的甲基丙烯酰胺修饰，以在所有反应中生成相同的磷酸化产物。通过SDS-PAGE分离反应混合物并进行染色监测MBP磷酸化的程度。结果发现在所有反应中均观察到了磷酸化的MBP（第2、3和4道）。（D）通过对C中四个独立实验的结果定量分析，相对于ATP（转化率为100%），ATP-Mac1和ATP-MAc 2转化率分别为68±9％和60％±9％。表明两种ATP-MAc类似物均具有可接受的转化效率。
图4、使用表皮生长因子受体（A）EGFR、B成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）、两种含半胱氨酸的激酶（C）PKA、（D）ERK2对ATP-MAc 1进行测试，以评估交联的相容性。箭头表示EGFR（A），FGFR4（B），PKA（C）或ERK2和p53（D），方括号表示由于交联而导致的更高分子量的复合物。用PD153035（PD）、星形孢菌素（ST）或厚朴素（MG）激酶抑制剂或碘乙酰胺（IA）处理激酶以使激酶半胱氨酸烷基化作为对照1。将二硫苏糖醇（DT）与ATP-MAc 1预孵育以使甲基丙烯酰胺基团失活作为对照2。EGFR和FGFR4控制与细胞增殖，分化，迁移和转录相关的关键信号通路。重要的是，EGFR和FGFR4会发生自磷酸化作用，并在ATP结合位点的铰链结合区和富含甘氨酸的环区具有反应性半胱氨酸，使它们易于与ATP-MAc进行激酶催化的交联。为了确认交联需要反应性半胱氨酸，对活性位点不含反应性半胱氨酸，但会发生自磷酸化作用的PKA激酶进行了相应测试。将EGFR，FGFR4和PKA与ATP-MAc 1分别孵育，然后在SDS-PAGE分离并用EGFR，FGFR4和PKA抗体显像后观察到交联。对于EGFR（89 kDa）和FGFR4（65 kDa），仅在存在ATP-MAc的情况下观察到高分子量交联复合物对应于二聚体（EGFR：178 kDa、 FGFR4：130 kDa）和三聚体（EGFR4：267 kDa、FGFR4：195 kDa）（A、B泳道5和1）。当用EGFR选择性抑制剂（A第2道）或FGFR4激酶抑制剂（B第2道）处理反应时，交联的复合物丢失，这与激酶依赖性一致。当在交联之前将激酶的半胱氨酸残基用碘乙酰胺烷基化时（A、B，泳道3），或者将ATP-MAc与巯基二硫苏糖醇一起孵育（A、B，泳道4）时，也没有交联的复合物，表明硫醇和丙烯酰胺官能团是交联所必需的。相反，在PKA中未观察到更高分子量的交联C，泳道5），这表明ATP-MAc 1仅使含半胱氨酸的激酶交联。通过ERK2与其已知底物p53的交联进一步测试ATP-MAc 1。 ERK2是MAP激酶途径中的下游激酶，与细胞分化，增殖和存活有关。与EGFR和FGFR4相比，ERK2中的活性位点半胱氨酸位于DFG区域，这将测试活性位点的半胱氨酸位置对交联的影响。ATP-MAc1与重组ERK2（68 kDa）的孵育导致形成了高分子量复合物，对应于ERK2二聚体（136 kDa）和三聚体（204 kDa）（D，泳道6），这一结果与EGFR和FGFR4相似。当包含p53（80 kDa）时，在高分子量（≈284 kDa）交联复合物中也观察到p53（D，泳道7），这表明p53在寡聚后与ERK2交联。在存在ERK激酶抑制剂厚朴素、碘乙酰胺和DTT的情况下，交联作用降低（D，第3-5道），证明了交联的激酶，半胱氨酸和丙烯酰胺依赖性。这些结果证实了ATP-MAc 1可以应用于多种含半胱氨酸的激酶与底物交联。（E）为了确认ATP-MAc 1可以使复杂的裂解物混合物中的激酶-底物对交联，用EGF刺激HeLa细胞激活EGFR激酶，将其裂解，然后与ATP-MAc 1孵育。在SDS-PAGE分离可视化，发现除了EGFR（175 KDa），还观察到了高分子量交联带（E，泳道3），这可能是EGFR-EGFR、EGFR底物和EGFR激酶复合物的组合。在没有EGF刺激或ATP-MAc（E，泳道1和2）或使用EGFR选择性抑制剂PD153035（E，泳道4）的反应中，交联复合物的反应减少，表明ATP-MAc在复杂细胞混合物中以激酶依赖性方式交联激酶-底物对。作者开发了一种基于亲和力的交联ATP类似物ATP-MAc，通过充当激酶的共底物，使激酶仅与活性位点半胱氨酸交联，且在裂解液混合物中依赖于激酶进行。这种半胱氨酸特异性交联剂避免了现有的ATP-光交联剂的紫外线需求和非特异性反应。在未来
