为大家分享一篇发表在J. Am. Soc. Mass Spectrom.上的文章，Tutorial: Chemistry of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry¹，该文章的通讯作者是来自美国ExSAR公司的Yoshitomo Hamuro教授。

氢氘交换质谱（HDX-MS）是一种描述蛋白质动力学的强大方法，主要应用于研究蛋白质表征、工艺优化、蛋白质突变的结构效应、蛋白质-蛋白质/小分子相互作用等，酶学、质谱技术和数据处理方法的进步使HDX-MS能够实现更高的分辨率。本研究着重于分析HDX-MS的化学过程，前半部分使用pKa值和质子转移理论推导了蛋白质中各个官能团的HDX速率，后半部分描述了影响主链酰胺氢交换速率的各种参数。

一、各官能团的HDX速率

氢氘交换反应由氢转移反应和氘转移反应组成，酸催化过程中先在目标官能团上加一个氘，再去除一个氢质子，碱催化过程中先在目标官能团上去除一个氢质子后再加氘，氘水催化的过程则都有可能。根据公式1一旦确定了二阶速率常数且只考虑以上三种催化时，可以通过公式2获得一阶HDX反应速率常数k_ch。其中在较低pH下，由于氨基质子化，应考虑到来自氨基的质子或氘转移反应；在较高pH下，由于去质子化，羧基等官能团对或氘转移反应影响不大。

接着，作者用质子转移理论估计了羟基、巯基、酚羟基、氨基、咪唑基、羧基、胍基、吲哚基团的HDX速率，并与实际观测数据进行了比较（图2）。

公式3. 根据Linderstrøm−Lang模型推导出的EX1、EX2模型中交换速率常数公式，其中K_app为观察到的交换速率，K_op为蛋白质结构打开常数，k_ch为化学氢氘交换速率。

公式4. 用吉布斯自由能ΔG_op表示打开常数K_op。

侧链、pH和温度会影响HDX过程。侧链效应对EX2时计算自由能ΔG_op具有很大影响，通常酰胺的C端侧链比N端侧链的作用稍强；庞大的疏水氨基酸（如Ile、Val和Leu）会降低HDX速率，也会更好的保护氘不被交换回去；极性氨基酸（如Cys、His、Asn和Ser）会加快HDX速率，但在回交时不能很好地保护氘，尤其当夹在两个His残基之间时。对此，Englander, S.W等人的最新成果提供了软件来计算侧链效应²。

N、C末端对解析HDX-MS数据以实现高分辨率十分重要，由于主链酰胺氢在淬灭时会以各自的速率失去氘，当蛋白被酶解为肽段时会引入许多新的N、C末端以及不同的回交率。最明显的末端效应是在淬灭条件下，肽的第一个酰胺氢的交换速度明显快于其余的主链酰胺氢，故通常假定肽的第一酰胺在淬灭过程中不保留氘，当N端氨去质子化时这种N端效应消失。但是当前两个残基中的一个或两个是大分子氨基酸（如Ile，Val和Leu）时，第一个酰胺上的氘不可忽略。与N末端相反，C末端的羧酸根基团使碱催化的氢交换反应减速，肽的最后一个酰胺氢的交换可能比其余主链酰胺氢的交换慢，当最后两个残基包括His、Asp、Cys、Gly、Glu、Ser和Glu时，可能会突出此影响。

pH影响HDX分析的各个方面，因为主链酰胺氢化学交换反应主要是酸或碱催化反应。溶剂影响主要在LC分离过程中突显出，添加有机溶剂后，碱催化反应的二级氢交换速率可能不会发生太大变化，酸催化反应的二级氢交换速率可能会略有变化，但由于反应机理复杂，很难在添加有机溶剂时精确估算。氢同位素的类型也会对主链酰胺氢交换速率有轻微影响（图3）。

综上，本文介绍了用于蛋白质的氢氘交换质谱所涉及的化学内容。首先使用质子转移理论和pKa值估算了蛋白质中所有类型的杂原子氢的速率，估算的HDX速率与大多数官能团的观测值非常吻合（吲哚和酰胺基除外，差异由反应机理解释）。其次讨论了影响主链酰胺氢HDX速率的因素，包括侧链、N/C末端、pH、温度、有机溶剂和同位素，这些因素对正确设计交换反应和下游过程，以及对HDX-MS数据的分析和解释十分重要。

文章引用：Hamuro,Y., Tutorial: Chemistry of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Society for MassSpectrometry 2021, 32 (1), 133-151.