色谱基础知识

第一部分 色谱基础知识


1、色谱起源

2、色谱定义

色谱法:利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术

流动相:携带样品流过整个系统的流体

固定相:静止不动的一相,色谱柱



3、色谱分类


1、高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

2、气相色谱 Gas Chromatography (GC)

3、薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC)

4、毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE)


4、色谱优点

1、同时分析

2、分离性能好

3、灵敏度高 (ppm-ppb)

4、进样量小 (1-100uL)


HPLC vs GC

液相色谱:以液体作为流动相的色谱分离方法

1、适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析

2、流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用


气相色谱:以气体作为流动相的色谱分离方法

1、适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析

2、流动相只起运载样品分子的能力


5、HPLC分类

1、正相模式 (NP-LC)

2、反相模式 (RP-LC)

3、反相离子对色谱 (IPC) 
4、离子交换色谱 (IEC)

5、尺寸排阻色谱 (GPC / GFC)


反相模式 (RP)

填料:C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基


相互作用力:

反相模式下流动相的选择:

优化水相(缓冲液)和有机相的比例非常重要(甲醇,乙腈和 THF 是常用的有机溶剂)


在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和pH值非常重要


增加流动相极性:


固定相极性变化对分离的影响:


固定相极性变化对分离的影响:


离子对色谱

离子对试剂

•阴离子化合物:氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵

•阳离子化合物:丁烷基磺酸钠(C4)、戊烷基磺酸钠(C5)、己烷基磺酸钠(C6)、庚烷基磺酸钠(C7)、辛烷基磺酸钠(C8)、癸烷基磺酸钠(C10)、十二烷基磺酸钠(SDS)


离子对色谱影响因素

•离子对试剂的类型

•离子对试剂的浓度

•流动相的pH


正相色谱

色谱柱:

•硅胶柱:常用

•氰基柱: 常用

•氨基柱: 分析糖

•二醇基柱: 分析蛋白质



相互作用力


氢键力

•如果样品有

–-COOH: 羧基

–-NH2: 氨基

–-OH: 羟基

则氢键力强.


•如果样品没有任何官能团,象碳水化合物

•如果样品有大的基团, 由于空间障碍

则氢键力弱.


正相模式下流动相的选择:

•主要试剂:烷烃(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烃(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳

•辅助试剂:甲基-t-丁基醚(MTBE)、乙醚、四氢呋喃(THF)、二氧杂环乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇

为了调整保留时间,可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。


增加流动相极性:


反相色谱与正相色谱的对比:

反相:保留时间重复性好、固定相耐用

正相:对立体异构体有很好的分离(Vitamin E等)、保留时间重复性稍差


离子交换色谱:


离子交换色谱应用:

生物领域(蛋白质, 农药, 氨基酸分析)

离子分析

阳离子交换剂:强阳离子交换剂(SCX)(R-SO3-)

弱阳离子交换剂(WCX) (R-COO-)

阴离子交换剂:强阴离子交换剂(SAX) (R4N+)

弱阴离子交换剂(WAX)(DEAE)


尺寸排阻色谱法(SEC)



第二部分 柱子基本性能参数


1、表征色谱柱的参数

硅胶纯度:填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度。

色谱柱尺寸:填料床的长度和内径。

颗粒形状:球型或不规则型。

粒径:平均颗粒直径,通常3-10μm。

表面积:颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示。

孔径:颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å。

碳百分率:与基体物质相连的键合相的量。

封尾:用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来。


2、表征色谱柱性能的参数

(1)容量因子, k'


(2)理论塔板数, N


(3)分离度, Resolution


完全分离时的分离度


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