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张玮成/郭以嵩/周佳海组合作Angew|铁和α-酮戊二酸依赖性氧化酶催化异腈生物合成机理

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遇见/摘要

ScoE与异腈的生物合成直接相关,本文解析了高分辨率的ScoE与其底物及推测中间体的复合物晶体结构,同时结合生物化学与生物物理学的手段,阐明了铁(Fe)和α-酮戊二酸(2OG)依赖性的ScoE催化异腈形成的分子机理,揭示了ScoE的催化功能。对比典型的Fe/2OG,这个反应是一个四电子氧化脱羧及去饱和反应的过程,并且历经了两次催化循环。


 

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遇见/内容


许多具有良好活性的天然产物中都存在异腈官能团。例如,抗病毒药黄嘌呤素,与毒性相关的酚氧化酶抑制剂-鼠李素以及许多海洋海绵衍生的代谢物等。但遗憾地是,此前对于异腈的生物合成只能通过5-磷酸化的核酮糖与酪氨酸或者色氨酸进行分子间的缩合得到(Brady, S. F. et alAngew. Chem. Int. Ed200544, 7063-7065.)2017年,加州大学伯克利分校的张文君课题组首次报道了以甘氨酸前体的异腈分子内生物合成途径(Harris, N. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017,114, 7025-7030.),确认ScoE蛋白与异腈的生物合成直接相关。2018年,该课题组与麻省理工学院的Drennan课题组合作解析了ScoE母体的晶体结构,证实ScoE属于Fe/2OG依赖性的加氧酶家族(Harris, N. C. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 201857,9707-9710.)。但在晶体结构中,他们捕捉到的是含锌(Zn)离子,而且缺乏与底物结合的复合物晶体结构,故由ScoE介导的异腈的生物合成催化机理仍然需要进一步的研究和阐释(Figure1)。

Figure 1两种不同的异腈生物合成方式。A) IsnA酶家族利用5-磷酸化的核酮糖合成异腈;B)(Fe)α-酮戊二酸(2OG)依赖性加氧酶催化的异腈合成


最近,美国北卡罗来纳州立大学的张玮成课题组、卡内基梅隆大学郭以嵩课题组及中国科学院上海有机化学研究所的周佳海课题组合作,解析了高分辨率的S. coeruleorubidus 来源的ScoE与其底物及推测中间体的复合物晶体结构,同时结合生物化学与生物物理学的手段,阐明了铁(Fe)α-酮戊二酸(2OG)依赖性的ScoE催化异腈形成的分子机理(Figure2),揭示了ScoE的催化功能。对比典型的Fe/2OG,这个反应是一个四电子氧化脱羧及去饱和反应的过程,并且历经了两次催化循环。

Figure 2. Fe2OG依赖性加氧酶催化的异腈生物合成机理

在前期工作中,张玮成课题组发现了与ScoE同功能的两个酶,它们分别是来自Streptomyces avermitilisSAV607S. thioluteusSfaA。对于这三个酶,周佳海课题组都进行了结晶条件的筛选,最终获得了ScoE与底物(1)和推测中间体(3)以及SfaA的母体结构,分辨率分别为2.18 Å2.17 Å2.23 Å。在ScoE•Fe•1晶体结构中,Y101K193G128Y96Y135R310与底物(1)之间的氢键作用可能起到锚定的作用,从而其电子密度可以被完整并清晰地观察到。另外,底物(1)C5-距离铁中心的距离为4.9 Å,而经Fe/2OG催化得到的推测中间体(3)朝铁中心移动了0.4 Å,缩短为4.5 ÅFigure3)。

Figure 3. A) ScoE•Fe•1的整体结构;B) ScoE•Fe•1ScoE•Fe•3活性位点。H132D134H295构成一个催化三联体,酒石酸(TAR)和甲酸(FMT)分子分别占据了2OG结合的位点。

Fe/2OG催化体系中,Fe(II)O2氧化形成Fe(IV)-oxo,而2OG则会变成琥珀酸。为了进一步阐明反应途径,张玮成课题组巧妙地通过定量催化时琥珀酸和产物(2)构建了2OG和底物(1)的化学计量关系。实验结果表明,SfaASav607ScoE催化反应时,琥珀酸和产物(2)的比例分别为2.33.24.5,揭示了异腈产物(2)的形成中可能涉及了两个Fe/2OG的催化循环。值得注意的是,当SfaA催化反应时,同位素标记的类似物(5-13C-1)2OG的比例为1:1.5时,13CC-H去耦合谱在~91ppm出现了一个新峰,同时C-H耦合谱于同一位置出现了双峰,暗示了推测中间体(3)的生成。随后,当5-13C-12OG的比例增加到1:2.5,作者观察到(3)的减少以及~150ppm处另一个新峰的生成。经证实,新峰与(2)的化学位移一致,这表明(3)可能作为底物参与了(2)形成的第二个Fe/2OG催化循环(Figure4)。
 
Figure 4. SfaA催化合成产物(2)13C-NMR

此外,郭以嵩课题组通过穆斯堡尔(Mössbauer)光谱分析证实了第一个Fe/2OG催化循环中Fe(IV)-oxo的形成。SfaA•Fe(II)•2OG•5-2H2-1SfaA•Fe(II)•2OG•1的光谱中观测到的四极双峰具有异构体位移值(δ)为1.23 mm/s和四极分裂值(ΔEQ2.74 mm/s。这样的四极双峰谱证实了铁中心在这两个酶的静止态是处于高自旋亚铁。当酶和底物5-2H2-1的反应在0.03 s被淬灭时,复合物SfaA•Fe(II)•2OG•5-2H2-1减少了30%,同时累积了一个新物种,而该新物种与其他的Fe/2OG酶催化中的Fe(IV)-oxo中间体类似(Figure5)。因此,Mössbauer光谱分析暗示反应可能从底物(1)C5-C-H羟化开始。

Figure 5. SfaA•Fe(II)•2OG•5-2H2-1SfaA•Fe(II)•2OG•1Mössbauer光谱分析

中间体(3)可能通过途径(i)生成化合物(4),紧接着(4)(5)C5-羟化后,快速地互变异构形成(6),接着再脱水或脱羧形成产物(2)。不过,中间体(3)直接羟化形成(6)后,通过(7)产生(2)也是另一种可能的途径(i)。为了揭示第二个循环中可能的反应途径,张玮成课题组合成了可能的中间体(4)(6),但遗憾地是,cis-(4)(6)和酶反应时均未检测到产物(2)。因此他们怀疑cis-(4)(6)也许并不是活性位点真正的中间体而是trans-(4)。或者存在第二种途径,Fe(IV)-oxo活化N4-经脱水形成(8),然后脱羧形成(2),即(3)→(8)→(2)
总体来说,作者利用生物化学、结构生物学和Mössbauer光谱分析揭示了Fe/2OG依赖的酶催化异腈生物合成途径经历了两个不同的反应。在第一个反应中,Fe/2OG催化底物(1)形成C5-羟化的中间体(3),而第二个反应中可能是通过一个脱羧协助的去饱和反应由中间体(3)最终形成产物(2),详细的机理还需要进一步的证实。
张玮成课题组的博士生Tzu-Yu Chen和周佳海课题组的博士生陈金凤并列论文第一作者。晶体衍射数据分别在上海光源BL17U1BL19U1线站收集。

 

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遇见/导师

张玮成博士,毕业于德州大学奥斯丁分校,北卡罗莱纳州立大学助理教授,主要研究铁和a-酮戊二酸氧化酶的催化合成机理。研究结合有机合成、生物化学以及生物物理学等多学科,探讨异腈基、双键、环氧等官能团在天然产物生物合成过程中的酶学机理,进而寻找潜在的候选药物。在Nature、Science、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem、Org. Lett. 等期刊上发表论文,引用次数高达1380次。主持美国国家卫生研究院(NIH)、美国国家科学基金(NSF)项目。荣获Faculty Research and Professional Development Program Award, North Carolina State University、Faculty Early Career Development Program (CAREER) Award: National Science Foundation。担任J. Am. Chem. Soc.、PNAS、Nat Commun、Nat Prod RepACS Chem Biol等国际知名期刊审稿人。课题组主页: https://changlab.wordpress.ncsu.edu/
 
郭以嵩博士,美国卡内基梅隆大学化学系副教授。研究方向为非卟啉铁蛋白酶和铁硫蛋白酶的催化机理,主要研究对象是铁和α酮戊二酸氧化酶催化机理,包括去饱和反应、环氧化反应、内过氧化反应和异腈生物合成反应。课题组结合运用酶动力学和光谱学(包括Mössbauer、EPR和基于同步辐射技术的光谱学)捕捉和表征催化中间体,同时运用量子化学计算推导中间体电子结构以获得对催化机理深层次的理解。在Nature、Science、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem、Biochemistry 等期刊上发表论文五十几篇。目前课题组非卟啉铁蛋白酶研究得到美国卫生研究院(NIH) R01和美国国家科学基金会(NSF) CAREER经费支持,铁硫蛋白酶研究得到美国能源部经费支持。课题组主页:www.chem.cmu.edu/groups/guo
 
周佳海博士,中国科学院上海有机化学研究所研究员。主要研究方向是工业生物技术、合成生物学相关的微生物酶学以及活性天然产物的化学生物学,通过会聚酶学、结构生物学及蛋白质理性设计等技术方法,重点研究酶的结构与催化机理、机制与分子改造、定向进化酶的科学规律等,近年来陆续在Nature、Nat Chem、Nat Chem Biol、PNAS、J Am Chem Soc、Angew Chem、Nat Commun ACS Catalysis 等期刊上发表研究成果。荣获中国科学院“百人计划”择优支持(2008)、药明康德生命化学奖“学者奖”(2018)陕西省千人计划创新短期项目(2018)、上海市优秀学术带头人项目(2019)。目前主持和参与国家自然科学基金重点项目、国家重点研发计划合成生物学专项、中科院国际合作项目等。

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遇见/致谢


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